INTRODUCTION AUX TECHNIQUES UTILISÉES EN BIOCHIMIE
ÉLECTROPHORÊSE DES PROTÉINES EN GEL DE POLYACRYLAMIDE


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Comme toutes molécules chargées, les protéines peuvent se mouvoir dans un champ électrique. Cette charge provient des groupements ionisables des chaines latérales de certains acides aminés composant la protéine. On peut donc se servir de l'électrophorèse pour les séparer. Les méthodes les plus performantes pour séparer les protéines sont faites en gel de polyacylamide (EGPA). L'électrophorèse en général est expliquée dans la section "électrophorèse" du SIITUB.



PRINCIPES DE BASE
Caractéristiques des protéines affectant la séparation
Charge
La charge nette d'une protéine est évidemment le principal facteur qui détermine la direction (d'après sa polarité vers l'anode ou la cathode) et la vitesse (donc la distance) de migration (proportionnelle à la densité de la charge) d'une protéine. La charge nette d'une protéine dépend du pI de la protéine et du pH du milieu ambiant. (Réviser au besoin ces concepts de pI vs pH vs charge nette d'une protéine ou d'un acide aminé)

Si on veut être rigoureux, il faudrait aussi tenir compte des contre-ions de petites tailles (K+, Na+, Cl-, etc.) qui s'associent aux groupements ionisables de charge opposée. Ces ions migrent en sens opposés aux protéines et, ce faisant, entraînent des molécules d'eau. Ce déplacement des molécules d'eau ralentit la migration des protéines. En pratique cependant, ces considérations complexes sont plutôt académiques et ont un impact faible en EGPA.

Souvent, on ajoute aux protéines un agent (généralement un détergent) qui se complexe à elles. Dans ce cas, la charge de cet agent peut déterminer la charge nette de la protéine, en fait du complexe protéine-détergent. Cela permet d'égaliser artificiellement la densité de charge de toutes les protéines de l'échantillon et de les séparer seulement sur la base de leur masse moléculaire.

Pour deux protéines ayant des charges nettes égales, il faut tenir compte de la densité de la charge (nombre de charge/unité de masse moléculaire). Ainsi, les autres facteurs étant égaux, une protéine ayant 80 charges négatives (nettes) ayant une masse relative 50 kDa migrera plus vite qu'une protéine de 100 kDa ayant aussi 80 charges négatives nettes.



Taille
La taille est un autre facteur qui détermine la vitesse de migration des protéines dans une EGPA. Plus la protéine est grosse plus elle sera retardée par les mailles du gel, donc plus elle migrera lentement. Il peut arriver qu'une protéine soit tellement grosse qu'elle ne puisse même pas se mouvoir dans le gel. Inversement il peut arriver qu'elle soit tellement petite qu'elle ne soit pas retardée du tout par les pores du gel.

Comme la taille d'une protéine est dépendante de sa masse moléculaire, on a souvent tendance à dire que la masse moléculaire est, en soi, le facteur qui détermine la séparation des protéines sur EGPA. Mais en général il s'agit d'une approximation (quelquefois trompeuse) puisque c'est bel et bien la taille qui est le facteur fondamental lié à la masse moléculaire.

La forme d'une protéine est importante. À masse moléculaire égale, une protéine globulaire (qui est plus ou moins sphérique) aura tendance à se déplacer un peu plus rapidement qu'une protéine fibrillaire (plus ou moins en forme de bâtonnet) parce qu'elle "se faufile" mieux dans les mailles du gel, sans avoir besoin de se réorienter constamment.

On peut contrôler la forme et la densité de charge des protéines pour les uniformiser afin de pouvoir les séparer sur la base du masse moléculaire. Pour cela, on utilise des détergents anioniques, comme le dodecylsulfate de sodium (SDS), ou cationiques, comme le bromure de cétyltriammonium (CTAB).



Hétéroprotéines
Beaucoup de protéines ne sont pas constituées uniquement d'acides aminés. Certaines d'entre elles contiennent divers types de groupements: polysaccharides (glycoprotéines), des acides gras (lipoprotéines), etc. D'autres peuvent avoir été modifées par phosphorylation (phosphoprotéines), méthylation, acétylation, etc. Ce sont des hétéroprotéines. Ces modifications covalentes peuvent affecter la migration. Ainsi l'addition de molécules chargées (e.g. le phosphate d'une phosphoprotéine) va augmenter ou diminuer la charge nette d'une protéine, avec les conséquences sur la vitesse de migration.

La présence d'oligosaccharides (glycoprotéine) aura aussi un effet. Évidemment cela va augmenter la masse moléculaire de la protéine. Mais comme ces groupements sont beaucoup moins compacts que les acides aminés et ont peu d'affinité pour les détergents, la géométrie (forme de la protéine) et la densité de charge sont affectées. Ce phénomène explique pourquoi la migration de protéines fortement glycosylées est anormale par rapport à des protéines non glycosylées de masse moléculaire identique.



Facteurs physico-chimiques affectant la migration
Les conditions physico-chimiques dans lesquelles on fait l'électrophorèse vont influencer sur la migration. Par exemple, il peut arriver que certaines des protéines à séparer puissent avoir une affinité non covente (lien hydrogène, interaction van der Vall, hydrophobe, etc.) pour la matrice dans laquelle la migration se fait. Cette affinité va évidemment retarder la migration des molécules. C'est une des raisons pourquoi l'acrylamide est une matrice très utile: elle n'est pas chargée et n'a pas d'affinité particulière pour les chaînes latérales des acides aminés apolaires.

Le pH peut évidemment avoir un role capital dans les élecrophorèses. C'est lui déterminera la charge des acides aminés des protéines, donc une composante importance du processus électrophorétique. De plus, il faut ternir compte que les protéines ne sont pas solubles ou stables dans toute la gamme des pH. Ainsi, des pH acides (< 5 pour la majorité des protéines) font précipiter les protéines en aggrégats plus ou moins massifs qui ne peuvent se déplacer dans le gel. D'un autre coté des conditions trop alcalines conduisent à l'hydrolyse de certains acides aminés ou du lien peptidique. En général, on maintient des conditions entre 6 et 10. Les histones, protéines très basiques, supportent bien des conditions acides.



Polymérisation de l'acrylamide
Il s'agit d'une réaction de polymérisation de monomères d'acrylamide. L'acrylamide (monomérique) a la formule chimique suivante:

CH2=CH-CO-NH2.
Notez la présence du double lien C-C à l'extrémité de la molécule.

Quand un des carbones impliqués dans le double lien prend, sous l'influence d'un initiateur, une forme radicalaire (radical libre), il peut attaquer le double lien C-C d'une autre molécule. La réaction peut se résumer de la façon suivante où "M" est un monomère, "I" l'initiateur, le symbole "*" indique un radical et "- "indique un lien covalent.

La chaîne réactionnelle commence par la formation spontanée ou induite d'un radical au niveau l'initiateur:

I -> I*
La propagation de ce radical enclenche alors la polymérisation:

M + I* -> M*
M* + M ->M-M*

M-M* + M -> M-M-M*

(répétition n autres fois de la réaction en chaîne)

M-M-M* + n M -> M-M-M-(M)n-M*
Ainsi les monomères d'acrylamide entrent ainsi une réaction en chaîne ou de longs polymères linéaires sont formés par la propagation de ces radicaux libres. En plus de l'acrylamide en tant que tel, la réaction de polymérisation doit se faire en présence d'agents réticulants et de catalyseurs de la réaction.

Réticulation
Une solution de polyacrylamide polymérisé seulement avec de l'acrylamide est cependant liquide, quoique très visqueuse, donc impossible à manipuler. En effet, l'acrylamide ne possède qu'un seul site de formation de radical par molécule et ne peut donc donner que des chaînes linéaires plus ou moins longues sans lien entre elles.


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Gel d'acrylamide polymérisé sans agent réticulant.
Il y a formation de longues chaines linéaires sans liens entre elles


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Au contraire, la présence d'agents réticulants permettra la formation de "ponts" entre les chaînes d'acrylamide. La solution formera donc un gel solide et manipulable, quoique flexible et plus ou moins fragile.Un agent réticulant ("cross-linker") peut s'incorporer dans les longues chaînes de polyacrylamide pour les relier entre elles et former un "filet" tridimensionnel qui sera solide et non pas liquide. Un agent réticulant est une molécule qui a deux doubles liens C-C, généralement un à chaque extrémité de la molécule. Chacun d'entre eux pourra dont s'intégrer dans le processus de polymérisation de deux chaînes voisines de polyacrylamide, les liant entre elles. Les gels obtenus sont solides, quoique plus ou moins fragiles selon les quantités d'acrylamide et d'agent réticulant.


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Acrylamide (monomère)



Agent réticulant



Illustration schématique de l'acrylamide et d'un agent réticulant

Remarquez que cette représentation ne respecte pas les angles interatomiques et n'est faite que pour faciliter les explications en illustrant de façon schématique les structures impliquées.

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Les agents réticulants ("cross-linkers") sont des molécules qui peuvent entrer dans le processus de polymérisation parce qu'elles possèdent, comme l'acrylamide, une structure chimique leur permettant de former et de propager des radicaux libres entre autres des doubles liens C-C. Mais ils possèdent cette structure en double, en général à chaque extrémité de la molécule.

Ils peuvent donc participer à la formation de deux chaînes linéaires d'acrylamide, ce qui permet la formation de "ponts" entre chacune de ces chaînes. Il en résulte donc un réseau complexe faisant songer à un filet tridimensionnel dont les "mailles", plus ou moins grosses laisseront passer les protéines plus ou moins facilement selon leur taille. Puisque le processus de polymérisation se produit de façon aléatoire, il y aura plusieurs grosseurs de maille dans un même gel.


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Gel d'acrylamide polymérisé avec agent réticulant.
Il y a formation de longues chaines linéaires liées entre elles par l'agent réticulant


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La proportion acrylamide/réticulant et la nature de ce dernier détermineront les capacités de séparation du gel en modifiant la porosité de ce "filet tridimentsionel". Ainsi, plus la proportion de réticulant est grande, plus les mailles seront petites. Cette grosseur aura une importance capitale dans la séparation des protéines. En effet, plus les mailles du gel sont petites plus il y aura un effet de "tamisage moléculaire" ralentissant les protéines qui auront à passer au travers.



Catalyseurs de la polymérisation
La polymérisation est donc initiée par la formation de quelques radicaux libres sur des doubles liens C-C de l'acrylamide ou de l'agent réticulant. Ces radicaux libres ne se forment pas spontanément sur l'acrylamide. Il faut mettre dans la solution des catalyseurs (ou initiateurs de la formation de radicaux libres).

Il faut donc ajouter à la solution un (ou des) catalyseurs capables, 1) d'initier la formation de radicaux libres qui pourront alors démarrer la réaction en chaîne de la polymérisation, ce sont des initiateurs, et 2) de stimuler la réaction de propagation des radicaux libres pour l'accélérer et l'empêcher de "s'étouffer", ce sont des accélérateurs. La formation de radicaux libres par ces composés peut être, soit, immédiate après leur mise en solution, soit, déclenchée par un phénomène physico-chimique. Généralement deux types de catalyseurs doivent être combinés: un initiateur de radicaux libres et un accélérateur.

Le TEMED (N,N,N',N'-tétraméthylènediamine) est presque toujours utilisé comme accélérateur. Le TEMED doit être sous forme basique pour avoir son action. Plus rarement on se sert du DMNAPN (3-diméthylaminopropionitrile).

Le persulfate d'ammonium (PSA) est souvent utilisé comme initiateur. Le persulfate forme spontanément des radicaux libres lorsque mis en solution. Un léger inconvénient de ce produit est qu'il introduit des ions (NH4+ et SO4-) dans la solution. On peut s'en débarrasser par une "pré-électrophorèse", en mettant le gel sous tension un certain temps avant le dépôt des échantillons. Les ions sortiront du gel sous l'influence du champ électrique. La pré-électrophorèse est cependant hors de question dans des système où des ions doivent être présents dans le gel. C'est particulièrement le cas des gels multiphasiques car la préélectrophorèse induirait le mélange des constituants ioniques des phases, ce qui empêcherait le phénomène de tassement. Cependant, les faibles quantités de PSA ont en général des effets négligeables, c'est pourquoi on essaie d'en minimiser la concentration quitte à ralentir le phénomène de polymérisation.

On peut utiliser aussi la riboflavine ou la riboflavine-phosphate qui est plus soluble. La riboflavine ne forme des radicaux libres que lorsque la solution est exposée à une lumière UV rapprochée (généralement de la lumière fluorescente suffit) qui provoque la photoactivation de ce produit et la formation de radicaux libres. Cette propriété est intéressante dans le cas où on veut contrôler précisément le début de la réaction de polymérisation. Elle est particulièrement utile pour faire des gels en gradients.

Il faut se rappeler qu'il est préférable de combiner un initiateur et un accélérateur pour que la polymérisation de l'acrylamide se fasse de façon rapide et fiable. Ainsi il faut toujours qu'il y ait du TEMED en présence de PSA tandis que la riboflavine fonctionne beaucoup mieux en présence de TEMED.

Ces produits initiateurs de polymérisation ot tendance à se dégrader avec le temps. C'est pourquoi un même lot de produit semble devenir inefficace après quelques mois de rangement. il est préférable de les garder au réfrigérateur. Malgré cela, ils finiront par perdre peu à peu leurs capacités, on peut alors augmenter les quantités utilisées.



Effets des conditions physiques et chimiques sur la polymérisation
Quelques produits peuvent inhiber la réaction de polymérisation de l'acrylamide. En particulier, ceux qui réagissent avec les radicaux libres sans s'intégrer dans la chaîne ont un effet très nuisible. En effet de tels produits vont "étouffer" la réaction en bloquant la propagation de la réaction d'une molécule d'acrylamide à l'autre.

L'oxygène moléculaire (O2) inhibe la polymérisation de l'acrylamide de cette façon. Lors de la préparation il faut donc minimiser le brassage excessif du mélange pour réduire la présence d'air dans le mélange. On peut aussi dégazer la solution d'acrylamide avant de la couler et d'induire la polymérisation.

D'autres produits peuvent interférer au niveau des réactifs eux-mêmes. Par exemple le TEMED doit être sous sa forme basique pour accélérer la réaction de polymérisation. Donc un produit abaissant le pH (donc un acide plus ou moins fort) ralentira ou bloquera la formation de gel d'acrylamide.

Les conditions physiques peuvent affecter la polymérisation de l'acrylamide. La température est un exemple. Plus la température est forte, plus les réactions chimiques en général sont accélérées. La polymérisation de l'acrylamide n'est pas différente des autres réactions et est donc plus rapide à haute qu'à basse température.

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MÉTHODOLOGIE ET TECHNIQUES
Montage du gel
On fabrique un gel de polyacrylamide en mélangeant les composantes de base: acrylamide, agent réticulant, tampons, détergents (s'il y a lieu), etc. Quelques secondes avant de "couler" le gel, on ajoute le catalyseur et l'accélérateur puis on verse immédiatement dans un moule. On coule la solution d'acrylamide avant qu'elle n'ait eu le temps de gélifier. On laisse polymériser le gel qui devient alors solide. Le moule contenant le gel solide est alors prêt à être introduit dans la cellule à électrophorèse. On ajoute les échantillons et on met le gel sous tension dans les conditions de voltage et de courant pour que les protéines migrent à la vitesse voulue. On démoule ensuite celui-ci pour colorer les protéines dans le gel ou soumettre à d'autres analyses (immunodétection, etc.)

Les échantillons sont dissouts dans un tampon contenant divers produits facilitant les procédures. Ce tampon comprend donc un agent destiné à augmenter la densité de l`échantillon. Généralement on emploi du saccharose ("sucrose") ou du glycérol. Un échantillon dense est plus stable, prévient le mélange de l'échantillon dans le tampon d'électrode. Pour faciliter la visualisation de la migration, on ajoute dans l'échantillon un traceur de migration ("tracking dye"). Ce produit est coloré et migre juste derrière le front d'ions, ce qui permet de visualiser facilement la migration. Le bleu de bromophénol est couramment employé. On arrête l'électrophorèse quand le traceur a atteint le bas du gel.

De nos jours les gels d'acrylamide sont essentiellement sous forme de gels plats où on peut creuser plusieurs puits permettant de séparer côte à côte plusieurs échantillons. Ceci est très utile pour comparer le contenu en protéines de plusieurs sources différentes. Ces gels plats sont faits en faisant un "sandwich" en joignant deux plaques de verre pour ne laisser qu'un espace de 0.5 à 1.5 mm d'épais dans lequel on introduit la solution liquide d'acrylamide.

Très peu utilisés de nos jours, sauf pour les séparations 2D, sont les gels cylindriques (en carotte) où la polymérisation se fait dans des tubes de verre de moins de 5 mm de diamètre interne. Chaque échantillon est mis dans un tube individuel. Certains prétendent que les cylindres donnent une meilleure séparation et sont plus fiables.

L'acrylamide commercial tend à se dégrader pour produire des dérivés généralement chargés. Ces dérivés interfèrent souvent avec la polymérisation ou la migration des protéines. Une façon de se débarasser de ces produits interférents est d'exposer l'acrylamide à une résine échangeuse d'ion mixte durant la préparation (e.g. Mallinckrod MB-1 ou BioRad AG 501-X8)/L ou un mélange de Dowex 1-X8 et Dowex 50W-X8). Une autre solution est de se procurer de l'acrylamide de haute qualité en petites quantités à la fois; cela est cependant assez couteux. Une autre approche consiste, lorsque c'est possible, de faire une prélectrophorèse.



Fixation et coloration
La façon la plus simple de visualiser le patron de migration des protéines est de les colorer. Avant de procéder à cette coloration, il faut "fixer" les protéines. En effet, lorsqu'on enlève la tension électrique, les protéines vont se mettre à diffuser dans le gel. Ceci va évidemment diminuer la résolution de la séparation. Pour éviter cette diffusion, on les fixe dans le gel, autrement dit, on les précipite dans le gel. Ces aggrégats de protéines intimement entremêlées dans les mailles du gel ne peuvent plus diffuser. Cette fixation se fait normalement en mettant le gel dans une acide dilué comme l'acide acétique ou l'acide trichloroacétique 1 à 10%. On peut omettre cette fixation si le colorant lui-même contient de l'acide dilué, cela permet de fixer les protéines en même temps qu'on les colore.

Le colorant le plus couramment utilisé est le bleu de Coomassie. Ce produit, en milieu acide et en présence de méthanol, a une grande affinité pour les protéines. Sa petite taille lui permet de pénétrer rapidement dans le gel pour atteindre les protéines. Sa solubilité dans l'acide permet de combiner la coloration des protéines et leur fixation. Après un certain, on peut transférer le gel dans une solution méthanolique acide pour enlever l'excès de colorant qui a diffuser dans le gel et empêche de voir les protéines. A la fin de cette décoloration, on obtient un gel transparent avec les bandes de protéines colorées en bleu. Le bleu de Coomassie est asez sensible. Il existe deux variétés de bleu de Coomassie. Le R250 est employé pour colorer les protéines, le G250 est plus indiqué pour les petites protéines et les polypeptides séparés dans des gels de fort %T. En effet, le G250 est une suspension colloïdale. ce colorant est assez sensible (limite de détection 0.5 ug et convient à la plupart des électrophorèse]

Une méthode extrèmement sensible est la coloration à l'argent (limite de détection 10 ng) (Merril et al, 1981). Elle est beaucoup plus sensible quoique plus complexe, nécessitant des produits et des solvants de haute qualité, et difficile à réussir.



Détergents et agents dénaturants
On utilise souvent des détergents dans la préparation des échantillons avant l'électrophorèse. Les détergents servent à dissocier les protéines pour éviter qu'elles ne forment des agrégats impossibles à séparer. La partie hydrophobe du détergent peut en effet interagir avec les chaînes latérales non chargées tandis que la partie hydrophile interagit avec les molécules d'eau. Cela permet la solubilisation maximale des protéines et le déploiement de ses parties hydrophobes. Certains détergents comme le dodécylsulfate de sodium (SDS) servent aussi à détruire la structure quaternaire des protéines pour séparer les protéines multimériques en leurs polypeptides individuels. La plupart des protéines peuvent complexer de grandes quantités de SDS, environ 1.4 g de dodécylsulfate/g de protéines (Reynolds et Tanford, 1970). Cela représente une moyenne de deux molécules de dodécylsulfate par résidu d'acide aminé. Cette quantité de molécules de dodécylsulfate complexées aux protéines est tellement grande que les protéines prennent une charge négative nette. Les charges endogènes sont tellement peu nombreuses par rapport à celles apportées par le dodécylsulfate, que les toutes protéines ont à toute fin pratique une densité de charge uniforme. Par exemple l'ovalbumine, une protéine de 43 kDa, possède une charge nette de -10 à pH 7.0 et de -200 après dénaturation au SDS.

Dans certains cas, on veut dénaturer les protéines sans changer leur charge. On utilise alors comme dénaturants des agents chaotropiques non ioniques comme l'urée.



Principaux agents réticulants
Il existe divers types d'agents réticulants qui auront des propriétés différentes, donc permettant de préparer des gels appropriés pour divers usages.

L'agent réticulant le plus utilisé est le N,N'-méthylène bisacrylamide, plus communément appelé "bis" ou "bisacrylamide". Structuralement, il peut être décrit comme deux molécules d'acrylamide jointes par un méthyle entre les deux atomes d'azote. Les liens chimiques du gel obtenu sont très stables et le gel obtenu est suffisamment solide pour être facilement manipulé.

Le diacrylamide de piperazine est un autre réticulant. Il permet d'obtenir des gels un peu plus solide et avec une résolution améliorée. Son principal avantage est de donner un bruit de fond moins grandeque le bis dans une coloration à l'argent. Il est cependant passablement plus cher.

D'autres agents réticulants peuvent être utilisés si on veut des gels "resolubilisables" après séparation des protéines, de façon à pouvoir récupérer ces dernières pour analyse, utilisation, etc. Cependant, ces produits donnent souvent des gels plus fragiles ou plus cassants. De plus, la quantité optimale pour séparer des protéines de masse moléculaires donnés reste à être déterminée.

Le BAC (N,N'-bisacrylylcystamine) a des liens disulfures qui peuvent être détruits par un réducteur de liens disulfures.

Le DATD (N,N'-diallyltartradiamide) a des liens diole, donnant un gel solubilisable à l'acide périodique, ce qui est pratique pour les comptages de radio-activité. Il donne aussi des mailles de gel plus grandes, ce qui est avantageux pour certaines protéines, mais désavantageux dans la plupart des cas à cause de la perte de résolution qui s'ensuit.

Le DHEBA (N,N'-dihydroxyéthylène bisacrylamide) a des liens diol et amido&endash;méthylol qui peuvent être détruits par l'acide périodique ou une base.



Contrôle de la porosité et pouvoir de séparation
La principale caractéristique d'un gel d'acrylamide est la taille des mailles du gel. Plus les mailles seront petites, plus les grosses molécules auront de la difficulté à avancer dans le gel, donc plus elles seront retardées. Inversement les molécules très petites pourront s'infiltrer et avancer dans le gel sans obstacles. On utilisera donc diverses grosseurs de mailles (ou porosité) selon que les protéines qu'on veut séparer sont petites ou grosses.

Une porosité de gel donnée n'est optimale que pour une gamme de taille relativement réduite car, et les protéines trop grosses, et les trop petites seront moins bien séparées. Les protéines trop grosses seront toutes ralenties et se démarqueront mal une de l'autre; quelque fois elles ne pourront même pas entrer dans le gel! D'autre part les protéines trop petites ne seront presque pas ralenties car l'effet de tamisage est négligeable. Elles migreront toutes pratiquement à la même vitesse. Il faut donc choisir la concentration d'acrylamide et d'agent réticulant pour optimiser la migration des protéines qui nous intéressent. On essaie de prendre une porosité qui fera migrer les protéines qui nous intéressent le plus vers le milieu du gel de séparation.

Ce choix repose sur deux facteurs principaux qui influenceront la taille des pores du gel: la quantité d'acrylamide et le rapport bisacrylamide/acrylamide (ou agent réticulant/acrylamide). D'une part, plus il y a d'acrylamide en solution au moment de la polymérisation, plus les mailles seront petites. D'autre part, plus le rapport bis/acrylamide est élevé plus les mailles seront petites. En effet, plus il y a de bis, plus les chaînes d'acrylamide seront réticulées, donc plus les pores seront petits.

On se sert donc souvent de deux valeurs pour caractériser la porosité d'un gel de polyacrylamide:

%A (A pour acrylamide) qui est la concentration totale exprimée (en g/100 mL) d'acrylamide
%T (T pour concentration totale) qui est la concentration totale exprimée (en g/100 mL) d'acrylamide et de l'agent réticulant;

%C (C pour "cross-linking") qui est le rapport (en %) entre les poids de l'agent réticulant sur celui de l'acrylamide et du réticulant combiné. Remarque: certains ne tiennent pas compte du poids du réticulant parce qu'il le considère négligeable.

Une autre façon d'exprimer la quantité de réticulant en terme de rapport entre les poids d'acrylamide et celui de réticulant. Ce rapport s'exprime généralement sous la forme acrylamide:réticulant, par exemple 25:1.

Exemple de calcul
Pour une solution de 50 mL contenant 5 g d'acrylamide et 100 mg de bisacrylamide on a:

%A = (5 g/ 50 mL ) * 100 = 10%
%T = [(5 + 0.10 g) /50 mL] * 100 = 10.2 % Å 10%

%C = (0.1 g / (5 g + 0.1 g) ) * 100 = .1.96% = 2%

Rapport acrylamide:bis = 50:1



Pour obtenir la meilleure résolution possible, le %C optimal devrait varier selon le %T. C'est pourquoi il est préférable de faire des solutions stock distinctes d'acrylamide et de bisacrylamide. Cela permettra de préparer des gels au %C optimal par rapport au %T. Au contraire on prépare une solution stock combinée d'acrylamide et de bis, on ne peut obtenir que le même %C pour toutes les %T. Il faut aussi se rendre compte que le %C des deux agents réticulants ne s'équivalent pas et qu'une porosité similaire sera obtenue avec deux %C similaire



Gels homogènes et en gradient
Habituellement on fait des gels ou la concentration d'acrylamide est homogène, c'est-à-dire constante dans toute la plaque de gel. Les gels homogènes permettent une séparation fine sur une plage réduite de masses moléculaires. Si on désire séparer deux protéines une de l'autre, il est donc plus efficace d'utiliser un gel homogène

Il est cependant possible de faire des gels ou la concentration d'acrylamide sera variable. Dans ce cas la concentration à la base du gel sera plus grande que celle au sommet. Ainsi dans un gradient 3 à 25%, les protéines rentrent d'abord dans le gel ou la concentration est de 3%, plus les protéines avancent dans le gel plus elles sont mises graduellement en présence de grandes concentrations d'acrylamide jusqu'à 25%.

Ce système permet une meilleure séparation générale des protéines sur une vaste gamme de masses moléculaires. En effet la taille des mailles du gel sera de plus en plus petite à mesure que les protéines avanceront dans le gel. Donc, au fur et à mesure de leur progrès dans le gel, les protéines finiront par être exposées à la concentration d'acrylamide optimale pour leur séparation.

La principale difficulté des gels en gradients est qu'il faut éviter que la polymérisation ne se produise durant le coulage du gel qui est un processus un peu lent. Pour cela, on utilise soit un initiateur de polymérisation activable à volonté, comme la riboflavine, ou de très faibles concentrations d'un iniateur spontané comme le PSA.


Systèmes discontinus
Souvent les tampons d'électrode et le tampon dans lequel l'acrylamide a été solubilisé (i.e. tampon du gel en tant que tel) sont les mêmes, il s'agit de systèmes qu'on qualifie de continus. Il existe cependant des modes d'électrophorèse où plusieurs tampons sont utilisés. On qualifie ces systèmes de discontinus ou multiphasiques.






Système continu Système discontinu
Résolution
plus ou moins bonne

dépendante de la taille de l'échantillon
bonne

indépendante de la taille de l'échantillon

Facilité d'emploi
facile

étapes peu nombreuses
plus complexe

étapes nombreuses

Acrylamide
1 seule concentration
2 concentrations

Systèmes tampons
1 seul
3 (tampon d`électrode, gel de tassement, gel de séparation)

Mécanisme de séparation
séparation immédiate selon la mobilité déterminée par la masse, la conformation, la charge, etc.
étape de tassement de l'échantillon précédent la séparation qui est basée uniquement sur la masse (en principe)



Les systèmes discontinus sont des systèmes triphasiques, c'est-à-dire contenant trois compartiments différents de pH et de composition ionique. Ces trois compartiments constituent respectivement trois parties du montage de l'électrophorèse: tampon d'électrode, échantillon et gel de tassement, ainsi que gel de séparation.

Les gels d'électrophorèse nécessitent souvent l'application de "grosses" quantités de protéines (pour une électrophorèse, grosses quantités veut dire plus de 75 µg !!!) pour pouvoir détecter les protéines peu abondantes du mélange. Cependant cela veut dire qu'il faut mettre de "gros" volumes (pour une électrophorèse gros volume veut dire plus de 50 µL !!!). Malheureusement, l'application de gros volumes donne une faible résolution des protéines. En effet les bandes de protéines individuelles seront toujours un peu plus épaisses que la bande originale de l'échantillon de protéines à cause de la diffusion des molécules durant la migration et la coloration. Pour résoudre ce problème, les systèmes discontinus triphasiques permettent d'appliquer de gros volumes d'échantillon qui vont se compacter en une zone mince dans un gel de tassement ( ou gel de concentration) avant d'être séparés en bandes bien résolues dans le gel de séparation.


Ce système comprend les compartiments suivants:

Le tampon d'électrode, dans lequel baignent la cathode et l'anode, et fait contact avec le gel en tant que tel. Il contient le tampon d'électrode (TEL) caractérisé par une abondance de l'ion de traîne ("trailing ion"), l'absence d'ion frontal et la présence tu tampon/contre-ion. Au pH du tampon d'électrode, l'ion de traîne est très chargé. Il n'y a évidemment pas d'acrylamide dans ce tampon.

L'échantillon de protéines qui contient les protéines dissoutes dans un tampon d'échantillon (TEC). Le TEC contient un marqueur de migration, un détergent, un agent réducteur de liens disulfure, etc., en plus du tampon de gel de tassement (TGT). Le TEC, comme le TGT, se caractérise par une abondance de l'ion frontal ("front ion"), mais ne contient pas d'ion de traîne, et contient évidemment le tampon/contre-ion. Au pH du TGT, l'ion de traîne sera peu chargé et l'ion frontal est très chargé. Il n'y a évidemment pas d'acrylamide dans le TEC.

Le gel de tassement ("stacking gel") est le gel dans lequel les protéines entrent dans l'acrylamide. Il sert à entasser les diverses espèces protéines en bandes très minces pour augmenter la résolution de la séparation. Dans cette section du gel les protéines ne se séparent pas, elles migrent ensemble en s'entassant dans un volume plus petit que le dépôt. Il contient le tampon du gel de tassement (TGT) caractérisé par une abondance de l'ion frontal ("front ion") et l'absence d'ion de traîne. Tel que mentionné précédemment, au pH du TGT, l'ion de traîne (quand il y entrera) deviendra peu chargé et l'ion frontal est très chargé. L'acrylamide y est très peu concentré de sorte que toutes les protéines migrent ensemble à la même vitesse.

Le gel de séparation ("separating gel") est le gel dans lequel les protéines entassées dans le gel de tassement se séparent les unes des autres. Il contient le tampon du gel de séparation (TGS) qui contient l'ion frontal (peu concentré). Au pH du TGS, l'ion de traîne et l'ion frontal sont très chargés, ils migrent donc tous deux très vite parce qu'ils ne sont pas ralentis par les mailles du gel. L'acrylamide y est plus concentré de sorte que les protéines se séparent puisqu'elles migrent à des vitesses différentes, étant retardées selon leure masse moléculaire.

L'ion frontal doit toujours conserver sa charge et être de très petite taille. Un ion inorganique (Cl, Na, etc.) est généralement employé à cette fin. Le contre-ion des ions de traîne et frontaux est normalement le produit tampon qui assure la stabilité du pH dans chaque compartiment. Donc, l'ion frontal est généralement aussi utilisé sous forme d'acide ou de base fortes servant à ajuster le pH du produit tampon. L'ion de traine doit être un produit pouvant changer de charge (très chargé à très peu chargé) en fonction du pH des divers compartiments. Un acide aminé ayant un pI entre les entre les deux pH, mais très près du pH du gel de tassement est souvent employé. On pourait aussi utiliser un produit ayant un pK adéquat pour que le produit adopte les charges requises par le processus. Il est le même dans chaque compartiment car il doit migrer, évidemment à contre-courant des ions frontaux et de traîne ainsi que des protéines, mais sans affecter le pH des compartiments qu'il traverse. De plus les pH choisis doivent être compatibles avec la stabilité et la solubilité des protéines.


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Diagramme de la structure d'un gel triphasique

Noter que seulement une rangée d'ions frontaux et de traine est illustrée pour simplifier l'illustration. Pour la même raison, les proportions respectives de chaque compariment et des molécules ne sont pas à l'échelle. Il est à remarquer qu'au début de l'électrophorèse il n'y a pas d'ion de traine présents dans le gel de tassement, ni dans l'échantillon de protéines, ni dans le gel de séparation. Au pH du tampon d'électrode, les les ions de traine (T) sont complètement chargés de sorte qu'il entrent et se meuvent très vite. Il est à remarquer qu'au début de l'électrophorèse il n'y a pas d'ions frontaux présents dans le tampon d'électrode.

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Lorsqu'on applique un voltage dans ce système, les ions frontaux vont se déplacer rapidement puisqu'ils ont une forte densité de charge. Les ions de traîne, en entrant dans l'échantillon qui a une composition de pH identique au gel de tassement, prennent une charge très faible et vont donc se déplacer très lentement. Ces deux ions vont se déplacer à des vitesses différentes. Ils vont donc créer un "vide" électrique entre les deux: l'espace ou l'ion frontal, très mobile, est déjà parti mais où l'ion de traîne, peu mobile, n'est pas encore entré. Dans des conditions électriques constantes ce "vide" aura toujours la même distance (1-2 mm). Ce "vide" électrique aura tendance à "aspirer" les molécules ayant une densité de charge et une mobilité intermédiaire. Dans notre cas, les protéines sont plus mobiles que l'ion de traîne, mais moins que l'ion frontal. Au fur et à mesure que ce système passe à travers l'échantillon de protéines, celles-ci s'entasseront donc dans cet espace séparant les deux ions. Le gel de tassement a une faible concentration d'acrylamide, de 3 à 5%, insuffisante pour séparer les protéines du mélange. Les ions ne sont évidemment pas retardés non plus par cette concentration d'acrylamide.


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Etat du système au avant l'application de la tension.

La tension vient d'être appliquée. Les ions frontaux ont avancé rapidement tandis que les ions de traîne, en entrant dans l'échantillon, sont devenus peu chargés et avancent plus lentement. Un "vide" électrique s'est formé entre les ions frontaux et de traîne. Les protéines avancent plus rapidement que les ions de traine mais plus lentement que les ions frontaux. Les ions frontaux ont commencé à "rattraper" les protéines.

Les ions frontaux et les ions de traîne et les protéines continuent d'avancer à leur vitesse. Le processus de tassement, amorcé dans l'échantillon, se poursuit dans le gel de tassement proprement dit. La distance entre les ions frontaux et de traîne se stabilise et les protéines commencent à s'y entasser.

Le processus se poursuit. La distance entre les ions frontaux et de traîne se maintient toujours et les protéines s'y accumulent de plus en plus.

Le processus se poursuit. La distance entre les ions frontaux et de traîne se maintient toujours et les protéines s'y accumulent de plus en plus.

Le processus de tassement est pratiquement terminé. Les protéines sont presque arrivées au gel de séparation. Elles se sont toutes entassées dans le "vide" électrique. Elles occupent un volume (en hauteur) beaucoup plus compact qu'au début. En entrant dans le gel de séparation, elles se sépareront selon leur masse.



Illustration schématique du processus de tasssement dans un gel triphasique
Noter que seulement une rangée d'ions frontaux et de traine est illustrée pour simplifier l'illustration.


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Le gel de séparation a une concentration en acrylamide plus forte que celle du gel de tassement, suffisamment pour séparer les protéines. Les ions frontaux ou de trainene sont cependant pas retardés par cette concentration d'acrylamide. Le pH du gel de séparation est compatible avec la charge que l'on veut donner aux protéines d'intérêt. Au pH du gel de séparation, l'ion de traîne reprend une charge qui lui permet de migrer aussi presque aussi rapidement que l'ion frontal. Donc, le "vide" électrique entre ces deux ions disparaît et l'effet d'entassement des protéines ne se fait plus sentir. Au pH du gel de séparation, les protéines deviennent généralement plus chargées. Mais comme l'acrylamide est substantiellement plus concentré, elles rencontrent une résistance qui les ralentit plus ou moins selon leur taille. La séparation des protéines s'effectue alors comme dans une électrophorèse normale.



Electrophorèse avec détergents
Diverses conditions afectent la migration et la séparation des protéine, parmi les plus importantes sont la géométrie et la charge des protéines. Si on veut les séparer selon leur masse moléculaire, il faut abolir les différences entre ces deux types de caractéristiques. Pour cela, on emploie des détergents cationiques (chargés positivement comme le bromure de cétyltriméthylammonium CTAB) ou anioniques (chargés négativement comme le dodécylsulfate de Na (SDS), le déoxycholate de sodium (DOC). Ce détergent confère une charge uniforme (positive ou négative selon le cas) et une conformation dénaturée similaire à toutes les protéines du mélange.

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APPLICATION À LA BIOCHIMIE
Preparation des échantillons et conditions de migration
Les échantillons de protéines qu'on dépose dans un puit de gel doivent être le plus possibles exempts de produits contaminants. Les ions sont particulièrement à éviter puiqu'ils peuvent nuire au déroulement correct des phénomènes électriques permettant la concentration des protéines dans le gel de tassement. Si on veut séparer des protéines métaboliquement marquées, par exemple avec un acide aminé, du phosphate, des précurseurs d'oligossacharides, etc., il faut aussi enlever les molécules qui ne se seraient pas incorporées dans les protéines. En effet elles peuvent souvent créer un bruit de fond réduidant la sensibilité d'une autoradiographie ou d'une fluorographie.

Plusieurs approches sont couramment utilisées pour éliminer ces contaminants. La plus simple est la précipitation acide des protéines avec de l'acide trichloroacétique. Les protéines précipitent dans ces conditions et peuvent ètre récupérées sous forme de sédiment après centrifugation, tandis que les petites molécules contaminantes restent dans le surnageant. Cette méthode a cependant plusieurs défauts. Elle ne permet pas une récupération de toutes les protéines et le précipité de protéines est souvent difficile à redissoudre. Une approche plus efficace quoique plus longue est la précipitation au phénol (Sauvé et al, 1995). Cette méthode vient du fait que les protéines en solution aqueusse mises en présence de phénol se dénaturent et, soit deviennent soluble dans le phénol, soit forment un film à l'interface eau-phénol; les petites molécules contaminantes demeurent dans la phase aqueuse. On peut donc récupérer les protéines et les soumettre à une électrophorèse. D'autres précipitation avec des solvants organiques (éthanol, acétone) sont aussi faisable mais ont aussi des inconvénients (SIITUB: Précipitation des protéines). Une façon très efficace, mais un peu plus couteuse, est l'emploi de tubes à centrifuger munis d'une membrane à dyalise (Salodof MacNeil (2003). En centrifugeant, on force les petites molécules et la gande majorité du solvant aqueux à travers la membrane et on peut recueillir à la surface de la membrane des protéines concentrées et débarassées des contaminants ayant une masse inférieure à la limite d'exclusion ("cut-off"), de l'ordre de 5 à 10 kDa. De nombreux fabricants fournissent ces dispositifs.

Il faut aussi que les conditions ioniques et de pH soient compatibles avec la stabilité des protéines analysées. On évite généralement les milieux acides ou trop alcalins. Pour la plupart des protéines, les pH acceptables sont de l'ordre de 6 à 10.

La chaleur perturbe aussi la migration électrophorétique. Il faut particulièrement éviter les situations où le gel est soumis à des températures différentes. Les gels en plaque sont particulièrement sensible et il était fréquent que les bordures des gels surchauffaient. Cela causait une migration plus lente des échantillons des puits périphériques caractérisé par des bandes protéiques ayant migré plus rapidement au centre du gel, créant un patron ayant la forme d'un sourire.... De nos jours cependant, les dispositifs à électrophorèse sont conçus pour assurer un refroidissement uniforme de tout le gel.

Le tampon dans lequel est dissout l'échantillon de protéine contient aussi un marqueur de migration ("tracking dye"), une petite molécule colorée, qui migre devant toutes les protéines permettant de suivre le progrès de la migration.



Électrophorèse des protéines en gel de polyacrylamide-SDS (EPGP-SDS) et estimation de la masse moléculaire
De nos jours, l'électrophorèse le plus utilisé est sûrement l'EGPA-SDS. Le système triphasique tris-glycine-Cl- est de loin le plus utilisé. Il a été développé par Laemmli (1970), d'où le nom électrophorèse de Laemmli qu'on lui donne quelquefois.

Il s'agit d'un système ou les protéines ont été traitées avec le détergent anionique, le SDS, tel que préconisé par Weber et Osborne (1969). Ce détergent s'adsorbe avec les protéines. Le traitement des protéines comprend aussi du b-mercaptoéthanol (bME) qui réduit les ponts disulfure et accentue encore l'uniformisation de la charge et de la géométrie des protéines. Un court traitement à la chaleur, généralement à 90-100°C, accélère les réactions de dénaturation des protéines du SDS et du bME. Le SDS détruit les structures secondaires, tertiaires et quaternaires des protéines; on dit souovent qu'il les "linéarise". De plus, il s'adsorbe sur les protéines pour leur conférer une charge négative. On obtient donc des protéines de géométrie et de densité de charge uniformes. La seule différence entre les protéines de l'échantillon devient leur masse, donc à toute fin pratique, leur taille.

La grande innovation de Laemmli a été de séparer les protéines traitées au SDS (un détergent anionique) avec le système triphasique très performant, au niveau de la résolution, à base de Cl- , glycine et tris développé par Davis et Ornstein (1969). L'ion frontal est le Cl- , dont la charge ne varie pas en fontion du pH. L'ion de traîne est la glycine. Cette dernière, dont le pI est de 6.0 (pK 2.34 et 9.78), est peu chargée à pH 6.8 (TGT) mais très chargée négativement à pH 8.8 (TGS et TEL). Le contre-ion et produit tampon est le tris (pK 8.08).

Une des utilités de l'EPGP-SDS est d'estimer la masse moléculaire des protéines qu'on sépare. Pour ce faire, il suffit de faire migrer dans le gel des étalons de masse moléculaire connue. On obtient une résolution enocre meilleure en employant un gradient de concentration d'acrylamide. On peut alors construire une courbe de distance de migration (ou Rf linéaire entre le) vs log (masse moléculaire). La masse approximative des protéines des échantillons pourra donc être facilement déterminée. Pour obtenir une mesure valable de la masse moléculaire, on doit faire migrer dans le même gel des étalons cote-à cote avec la protéine dont on veut connaitre la masse. Il est important de choisir des conditions de migrations, essentiellement la porosité du gel (%A et %C) où les étalons auront une relation Rf vs log MM et que la protéine de masse inconnue migre à l'intérieur de la zone de linéarité. Plus il y a d'étalons dans la zone de linéarité, meilleure est la détermination de la masse. Le Rf est le rapport entre la distance de migration de la protéine (échantillon ou étalon) et le front d'ion déterminé par la position d'un indicateur coloré (bleu de bromophénol). La compagnie BioRad a produit un dépliant (en format pdf) sur le sujet.

Cette méthode a une précision satisfaisante mais n'est pas infaillible. En effet, la mobilité de la majorité des protéines varie entre 5-20% par rapport la moyenne (Weber et Osborne, 1969) . De plus, quelques protéines ont un comportement carrément anormal. En effet, même si la grande majorité des protéines adsorbent entre 1.1 et 1.7 g de dodécylsulfate par g, certaines ont une faible affinité pour ce détergent (Nelson, 1971; Rizzolo et al, 1976). Par exemple la papaïne et la glucose oxydase ne lient que 0.2 g de dodécylsulfate/g, ce qui leur donne une densité de charge réduite par rapport à la moyenne des protéines. Une autre exception est celle des protéines fortement glycosylées. En effet les résidus glycosyles de ces protéines ne se lient pratiquement pas au SDS, impliquant encore une fois une densité de charge réduite. Certaines protéines, comme les histones et des protéines ribosomiques, sont très basiques et ont un grand nombre de charges positives proportionnellement aux molécules de dodécylsulfate qu'elles peuvent complexer. C'est pourquoi on doit considérer que l'EPGP-SDS ne permet de mesurer qu'une masse moléculaire apparente.

Une variante de l'EPGP-SDS est le système tris-tricine. Il vise à solutionner la limite majeure du système de Laemmli, le manque de résolution des polypeptides de petite masse moléculaire (< 10-15 kDa). En effet ceux-ci sont emprisonnés dans les micelles de SDS qui migrent derrière le front d'ions et ne sont pas séparées. En remplaçant la glycine par la tricine (un tripeptide de glycine) on peut dissocier les petits polypeptides, aussi petits que 1 kDa, des micelles de SDS, ce qui leur permet de migrer selon leur masse.


Autres systèmes de séparation électrophorétique des protéines
Un système triphasique basé sur un autre détergent a été mis au point, mais il est beaucoup moins employé. Ce système utilise comme agent dénaturant le détergent cationique bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB). Le principal avantage du CTAB est qu'il engendre une dénaturation généralement réversible des protéines, contrairement à celle du SDS qui est généralement irréversible.

Si on veut dénaturer les protéines sans affecter leur charge intrinsèque, on peut utiliser l'urée, un agent chaotropique non ionique. Des concentrations de l'ordre de 6 M d'urée sont requises et la migration se fait en milieu acide.



Électrophorèse préparative
On peut utiliser l'électrophorèse comme étape de purification de protéines. Généralement on utilise des conditions de migration non dénaturantes pour préserver les protéines.

Il existe un montage spécialisé à cette fin, il ressemble à une colonne à chromatographie munie d'électrodes. Il s'agit d'un gros tube cylindrique dans lequel on peut couler de l'acrylamide. On dépose l'échantillon pour le soumettre à l'électrophorèse. On continue la migration sans l'arrêter et on recueille les fractions protéiques au fur et à mesure qu'elles sortent du gel.

Une approche plus simple, quoique plus "artisanale", est de faire l'électrophorèse dans un gel plat conventionnel sauf que les puits sont très grands et peuvent contenir un grand volume d'échantillon. Après le temps voulu, on récupère le gel, on le coupe et on récupère la bande dans laquelle est la protéine qu'on veut isoler. On broie cette bande pour en libérer les protéines. Pour ce faire, on peut utiliser un broyeur de type "Potter-Evelhjem", un sonicateur, etc. Pour faciliter cette extraction, on peut polymériser l'acrylamide avec un agent réticulant solubilisable (e.g. BAC avec b-mercapto-éthanol).



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Historique
création: 99 05 04

modifications mieures: 00 04 27

RÉFÉRENCES ET BIBLIOGRAPHIE
Bio-Rad (2000) Acrylamide polymerization - A practical approach. Bulletin 1156, Bio-Rad Lab., Richmond (Ca, USA). [dépliant sur les principes de base des gels d'acrylamide, particulièrement de leur fabrication].

Bio-Rad (1996) Ready Gel System - Resource guide, Bio-Rad Laboratories, Richmond (Ca, USA) [brochure publicitaire donnant des informations très utiles orientées vers les aspects pratiques de l'électrophorèse: séparation en gel et dénaturant, coloration]

Bio-Rad (2004) Molecular weight determination by SDS-PAGE, BioRadiation 114:25-7.[dépliant sur les principes de base de l'estimation de la masse moléculaire des protéines par EGPS-SDS].

RF Boyer (1993) Modern experimental biochemistry, Addison-Wesley Publishing Company, Reading (USA), p. 117-26. [description générale de l'électrophorèse des protéines en gel de polyscrylamide]

RMC Dawson, DC Elliot, WH Elliot, KM Jones (1986) Data for biochemical research, Clarendon Press, Oxford, p.449-52 [recettes des colorants et liste de références techniques]

RL Dryer, GF Lata (1989) Experimental biochemistry, Oxford Univesity Press, Oxford

BD Hames (1981) An introduction to polyacrylamide gel electrophoresis in (BD Hames, D Rickwood, éd.) Gel electrophoresis of proteins, pp.1-92, IRL Press, Oxford

P Kamoun (1977) Appareils et méthodes en biochimie, Flammarion, Médecine-Sciences, Paris.

UK Laemmli (1970) Cleavage of strucutral proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227:680-5 [utilisation du système glycine-Cl--tris avec traitement au SDS].

M le Maire, R Chabaud, G Hervé (1990) Un modèle d'étude: l'aspartate transcarbamylase, Masson, Paris, p.45-66 [développement de la théorie et de la pratique de l'EPGP].

CR Merril, D Goldman, SA Sedman, MH Ebert (1981) Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinal fluids, Science 211:1437-8 [développement de la technique originale de coloration à l'argent].

CA Nelson (1971) J. Biol. Chem. 246:3895-3901. [démonstration que certaines protéines se lient très faiblement au SDS]

DT Plummer (1987) An introduction to practical biochemistry (3e édition), McGraw Hill Book Co., London.

JA Reynolds, C Tanford (1970) The gross conformation of protein dodecylsulphate complexes, J. Biol. Chem. 245:261-65 [étude des interaction SDS-protéines].

LJ Rizzolo, M. LeMaire, JA Reynolds, C Tanford (1976) Molecular weight and hydrophobicity of of the polypeptide chain of sarcoplasmic reticulum calcium(II) adenosine triphosphatase and of its primarytryptic fragments, Biochemistry 15:3433-7 [variation de certaines protéines dans leur capacité de lier le SDS].

Salodof MacNeil J (2003) Preparing Proteins For 2-D Gel Analysis, new kits add speed and reproducibility to old method, the-scientist (may)

Sauvé et al (1995) Concentration of dilute protein dor gel electrophoresis, Anal. Biochem. 226:382-3. [concentration des protéines par precipitation au phénol]

K Weber, M Osborn (1969) The reliability of molecular weigth determinations by dodecylsulfate gel electrophoresis, J. Biol. Chem. 244:4406-12. [mise au point de l'emploi de SDS pour donner aux protéines ne densité de charge et une géométrie homogènes permettant d'estimer leur masse moléculaire par électrophorèse]


issaka salia ousseini


etudiant en en biotechnologie 4 à la fstg de marrakech

email:issakasalia@yahoo.fr

Le maïs, plante tropicale cultivée, est apparu il y a environ 8 000 ans en Amérique centrale. Toutes sortes de types de maïs se sont peu à peu développés avec l'aide de ses premiers sélectionneurs, les Amérindiens. Au Canada, les travaux de sélection visent essentiellement à mieux adapter cette culture à nos saisons tempérées et courtes. Une meilleure adaptation à notre climat se traduit à son tour par une meilleure qualité et des rendements plus élevés.

La création d'un maïs hybride est un processus lent et coûteux. Les nouveaux hybrides doivent se montrer supérieurs en ce qui concerne le rendement, la résistance à la verse, la résistance aux parasites et la tolérance à divers stress. Ces travaux nécessitent l'expertise de généticiens, d'entomologues, de pathologistes, de physiologistes et de nombreux autres spécialistes. La mise au point d'un hybride commercial comprend cinq étapes principales :

identification du matériel génétique parental approprié;
développement, à partir des populations parentales, de plantes autofécondées supérieures;
évaluation des plantes autofécondées par des expériences de croisement;
détermination d'une ou de plusieurs combinaisons hybrides supérieures;
essais à plusieurs endroits du ou des hybrides pré-commerciaux.
Une fois l'hybride mis au point, on procède à la multiplication de la semence et à la commercialisation de ce dernier.

Pour comprendre ce processus, il faut une certaine connaissance de la morphologie de la plante de maïs et des techniques de sélection générales. Le maïs possède des fleurs mâles et des fleurs femelles séparées (figure 1). La fleur mâle, celle qui produit du pollen, est la panicule; la fleur femelle est l'épi. L’épi fécondé d’un maïs hybride consiste généralement en des centaines de grains fixés sur un axe central (rachis ou rafle). Il est enveloppé de grandes bractées (feuilles modifiées) qui forment la spathe. Chaque grain naît d’un ovule et possède son propre filament (soie) qui sort de la spathe au sommet de l'épi.

Une fois la panicule entièrement dégagée de la gaine de la dernière feuille, la libération du pollen commence à s’opérer à partir du milieu de l'axe central de la panicule avant de s’étendre à toute celle-ci. Les grains de pollen sont contenus dans des anthères qui s'ouvriront dans des conditions atmosphériques appropriées. La dissémination du pollen par la panicule commence habituellement deux ou trois jours avant l'apparition des soies et peut durer plusieurs jours par la suite. Les grains de pollen étant très légers, ils peuvent être transportés par le vent sur d’énormes distances. Mais si la panicule est trop humide ou trop sèche, elle cessera d’en libérer. Les grains de pollen ne sont viables que 18 à 24 heures.

Les soies, quant à elles, sont couvertes de poils fins et gluants qui captent les grains de pollen. Après être tombé sur une soie, le grain de pollen germe, c’est-à-dire qu’il produit un tube pollinique qui descend le long de la soie pour aller féconder l'ovule (le futur grain). Ce phénomène dure habituellement entre 12 et 28 heures. Dans des conditions propices, toutes les soies apparaîtront et seront prêtes à être pollinisées dans les trois à cinq jours qui suivent. En général, il y a amplement de pollen puisqu'une panicule peut produire jusqu'à cinq millions de grains (soit l’équivalent d’environ 5 000 pour une soie). Une piètre pollinisation s’explique donc souvent par un manque de synchronisation entre la sortie des soies et la libération du pollen. Un mauvais rendement de grains résultera surtout de conditions environnementales inclémentes au moment de la pollinisation.

Parce qu'il porte des fleurs mâles et des fleurs femelles séparées, le maïs est allogame, c’est-à-dire qu’il se reproduit naturellement par pollinisation croisée. Comme les ovules peuvent être fécondés par du pollen venant de plantes voisines, on veillera, dans un programme d'amélioration génétique, à ce que le pollen de la panicule appropriée fertilise les ovules de l'épi voulu. On y parvient souvent au moyen d’une pollinisation manuelle. Pour ce faire, on couvrira l'épi d’un petit sac de papier (« sac à épi ») dès qu’il commencera à pointer à l'aisselle des feuilles (figure 2). Ainsi, l’épi continuera de croître et produira des soies, mais il sera impossible pour le pollen de tomber sur celles-ci. Quand débute la dissémination du pollen, on enveloppe la panicule d'un sac de papier (« sac à panicule »), que l'on fixe à sa base par une agrafe ou un trombone, afin de capter le pollen qui est libéré. Le lendemain, on retire le sac de la panicule pour le substituer rapidement à un sac à épi couvrant un épi doté de soies. De la même façon, on peut aussi envelopper la panicule d’un sac de papier cristal translucide et l'agiter pour faire tomber le pollen dans un coin du sac. On déchire ensuite ce coin et l'on dépose le pollen sur les soies (figures 3a, 3b), puis l'on couvre rapidement tout l'épi d'un sac à panicule en papier brun. Dans les deux techniques, on entoure la tige avec le sac à panicule, que l'on agrafe et agite afin de faire tomber les grains de pollen sur les soies (figure 3c). On dit qu'une plante est autofécondée quand le pollen d'une panicule est déposé sur les soies de l'épi de la même plante (figure 4). En revanche, une plante est dite « croisée » (ou « allofécondée ») quand le pollen d'une panicule est versé sur les soies d'une plante différente (figure 4). Parmi les millions de pollinisations manuelles effectuées par les sélectionneurs de maïs, seule une quantité infime donnent lieu à une plante autofécondée supérieure qui servira au développement d'un hybride commercial.

De 1850 à 1910, les sélectionneurs de maïs nord-américains mirent au point des variétés de maïs à rendement supérieur issues d'une pollinisation libre. On laissait les plantes dans un champ donné libérer du pollen sans prendre soin de couvrir les soies, de sorte que l'on obtenait sur chaque épi un mélange de grains issus de croisements et d’autofécondations. Les meilleures plantes étaient sélectionnées, et l'on gardait leurs épis (généralement les plus gros du champ) comme semence pour l'année suivante. Les plantes résultantes étaient ensuite soumises à une sélection améliorative axée sur des caractères agronomiques, mais elles présentaient des variations, entre autres, de hauteur, de longueur d’épi et de maturité en raison de pollinisations croisées répétées. Dans les années 1920, on découvrit le concept de la vigueur hybride (hétérosis). Si des plantes de maïs étaient autofécondées à répétition pendant six générations ou plus, elles devenaient plus petites (en raison d'une diminution de la vigueur), mais, par contre, plus uniformes pour tous les caractères. Une sélection peut être pratiquée à chaque génération pour l'obtention de caractères précis, comme la résistance aux parasites, le type de plante ou le type d'épi, la grosseur de celui-ci, etc. Cette sélection produit ce que l'on appelle une lignée autofécondée ou pure. On peut en accélérer le développement en la cultivant à contre-saison dans une pépinière sous des climats méridionaux plus chauds.

Une lignée autofécondée est génétiquement uniforme pour tous les caractères et donnera une descendance qui lui sera identique. La vigueur hybride est démontrée par le croisement (allofécondation) de deux lignées autofécondées dont les ancêtres ne sont pas apparentés (figure 5). Les descendants d'un tel croisement se caractériseront par la grosseur de l’épi et la robustesse de la plante. Ils seront aussi uniformes pour la plupart des caractères. Il existe de nombreuses théories pour expliquer le phénomène de la vigueur hybride, mais peu sont entièrement satisfaisantes. Si, par contre, l'épi d'un maïs hybride est autofécondé, sa descendance ne sera pas génétiquement uniforme, présentera des hauteurs variables et donnera des rendements plus faibles. C'est pourquoi les agriculteurs doivent racheter de la semence de maïs hybride chaque année et ne pas garder les grains produits par un champ de maïs hybride pour s’en servir comme semence l’année suivante.

Le développement de lignées autofécondées accapare environ les trois quarts des ressources d’un programme d'amélioration génétique du maïs. Le plus gros du travail consiste à évaluer si la lignée autofécondée, lors d’un croisement à une autre lignée qui est appelée « testeur », produira un hybride doté d'un rendement élevé et de bons caractères agronomiques. Cela s'appelle évaluer l'aptitude à la combinaison de la lignée autofécondée. L'hybride issu du croisement est appelé « hybride d'essai ». Le comportement sur le terrain de cet hybride d'essai fait l'objet d'une vaste évaluation sur le terrain dans des essais répétés effectués à plusieurs endroits. Les lignées autofécondées dont les hybrides d'essai se distinguent par un comportement supérieur sont retenues et mises à la reproduction. Si la sélection pouvait se faire au niveau des lignées autofécondées, ce serait formidable. En effet, les essais pourraient être nettement moins chers si l'on pouvait prédire, à partir du comportement ces lignées comme telles, celui des hybrides d'essai. Cette prédiction est possible pour certains caractères comme la précocité, la hauteur de la plante et la résistance aux maladies, mais malheureusement impossible pour le rendement. En plus d'avoir une bonne aptitude à la combinaison, une lignée autofécondée doit être facile à entretenir et à croiser pour que les coûts de production de la semence hybride demeurent bas et que les rendements en semence de qualité restent uniformément bons.

Les semences pures ou d'obtenteur des lignées autofécondées utilisées dans le développement d'hybrides commerciaux doivent être maintenues par pollinisation manuelle. Pour la production d'hybrides, on peut augmenter la semence pure en cultures isolées qui doivent être plantées à au moins 200 mètres de distance de tout autre champ de maïs. Pour chaque hybride commercial, il faut produire de grandes quantités de semence de ces lignées autofécondées parentales et de l'hybride afin de pouvoir offrir aux producteurs un approvisionnement suffisant de grains. On produit la semence hybride en plantant ensemble les lignées autofécondées « femelle » et « mâle » dans un champ. La décision de désigner quelle lignée autofécondée sera femelle et laquelle sera mâle dépend des caractères de l'épi et de ceux de la panicule de chacune : en général, la lignée femelle présentera un rendement semencier particulièrement élevé, tandis que la lignée mâle produira du pollen en abondance. Le rapport entre le nombre de rangées femelles et celui de rangées mâles varie selon les différentes entreprises semencières. La plantation peut se faire à des dates différentes pour assurer la synchronisation entre la floraison des plantes mâles et celle des plantes femelles. Les plantes des rangées femelles sont castrées (écimées) mécaniquement ou manuellement peu après la sortie des panicules de la gaine de la feuille supérieure et avant qu'elles commencent à libérer du pollen. Les champs commerciaux de maïs de semence sont généralement récoltés à l'aide d'une ramasseuse-dépanouilleuse, et les épis dépouillés sont soumis à un tri qui élimine les épis aberrants et les impuretés. Les épis sont séchés et égrenés, puis la semence est nettoyée et classée. On effectue également des essais de germination et l'on traite la semence avec un fongicide avant de l'emballer.

De nos jours, plus de 80 p. 100 du maïs cultivé en Amérique du Nord sont des hybrides simples de cette nature. Les 20 p. 100 qui restent consistent en des croisements doubles, à trois voies ou modifiés (parents de lignées apparentées). Les rendements y sont passés d'environ 1,3 Mg/ha en 1930 à 8,7 Mg/ha en 1994, soit environ 0,078-0,110 Mg/ha par année. Cette augmentation constante s'explique par l'amélioration des hybrides, l'usage accru d'engrais, une lutte plus efficace contre les mauvaises herbes, l'augmentation des densités de plantation et une meilleure gestion.


Fig. 1 (cliquez sur l'image pour voir un agrandissement). Morphologie générale d'une plante de maïs. La fleur mâle (panicule) étant distincte de la fleur femelle (épi), le maïs est une plante dite « allogame », c'est-à-dire qui se reproduit naturellement par pollinisation croisée.


Fig. 2 (cliquez sur l'image pour voir un agrandissement). Les épis de ces plantes de maïs ont été couverts d'un sac à épi en papier cristal blanc avant l'apparition des soies. Ce sac empêche le pollen de féconder les soies.



Fig. 3a (cliquez sur l'image pour voir un agrandissement). Pollinisation du maïs. Le coin d’un sac à panicule en papier cristal contenant le pollen est déchiré.



Fig. 3b (cliquez sur l'image pour voir un agrandissement). Le pollen est rapidement répandu sur les soies (les grosses particules sont des anthères provenant de la panicule).



Fig. 3c (cliquez sur l'image pour voir un agrandissement). Après la pollinisation, on place un sac de papier brun sur l'épi, dont on fixe les extrémités autour de la tige en les agrafant.

Fig. 3. Pollinisation du maïs. Le coin d’un sac à panicule en papier cristal contenant le pollen est déchiré (a), et le pollen est rapidement répandu sur les soies (b) (les grosses particules sont des anthères provenant de la panicule). Après la pollinisation, on place un sac de papier brun sur l'épi, dont on fixe les extrémités autour de la tige en les agrafant (c).

Fig. 4 (cliquez sur l'image pour voir un agrandissement). Autopollinisation et pollinisation croisée. Une plante est dite « autofécondée » quand elle est fécondée par le pollen provenant de sa propre panicule; elle est dite « croisée » ou « allofécondée » quand elle l’est par du pollen provenant de la panicule d'une autre plante.


Fig. 5 (cliquez sur l'image pour voir un agrandissement). On obtient un hybride en procédant à la pollinisation croisée de deux lignées autofécondées compatibles, mais habituellement d’ascendance différente. La plante hybride est beaucoup plus grosse et plus robuste que ses deux parents. Ce phénomène est appelé vigueur hybride ou hétérosis.


issaka salia ousseini
etudiant en biotechnologie végétale 4 à la fst de marrakech
email:issaka salia ousseini
tel:+21274228656
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La microbiologie est la science qui étudie les micro-organismes (ou microorganismes).

Les micro-organismes constituent un groupe très diversifié, ils existent à l'état de cellule isolée ou en groupe. Ils sont de petite taille.

Comment distinguer les cellules microbiennes des plantes ou des animaux ? Les cellules animales et végétales sont incapables de vivre à l'état isolé dans la nature ; elles sont toujours à l'état multicellulaire. Les virus ne sont pas des micro-organismes car ils ne sont pas autonomes, ils ne peuvent pas se reproduire sans détourner la machinerie cellulaire d'un autre individu.

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Sommaire [masquer]
1 Historique
2 Classification
3 Caractéristiques
3.1 Les procaryotes (ou bactéries)
3.1.1 Autres règnes
3.2 Les eucaryotes
3.2.1 Algue
3.2.2 Champignon
3.2.3 Protozoaire
3.2.4 Autres règnes
4 La taille des micro-organismes
5 La culture des micro-organismes
5.1 Richesse du milieu
5.2 Diversité du milieu de culture
6 La stérilisation
6.1 La chaleur
6.1.1 Cas particuliers : la pasteurisation et tyndallisation
6.2 La filtration
6.3 Radiation et agent chimique
7 Notion de culture pure
7.1 Technique des stries
7.2 Technique de suspension dilution
8 Identification des bactéries
8.1 Critères morphologiques
8.1.1 Macroscopique
8.1.2 Microscopique
8.1.2.1 Coloration de Gram
8.1.2.2 Forme
8.1.2.3 Mode de groupement
8.1.2.4 Taille
8.1.2.5 Présence de spore
8.1.2.6 Mobilité
8.1.2.7 Capsule
8.2 Critères biochimiques
8.3 Critères génétiques
8.4 Systématique bactérienne
8.4.1 Coques à Gram positif et catalase positive
8.4.2 Coque à Gram positif et catalase négative
8.4.3 Coque à Gram négatif
8.4.4 Bacille à Gram positif
8.4.5 Bacille à Gram négatif
8.4.5.1 Oxydase négative
8.4.5.2 Oxydase positive
9 Les agents antibactériens
9.1 Les agents physiques
9.2 Les agents chimiques
10 Les antibiotiques
11 Les résistances aux antibiotiques
12 La croissance bactérienne
12.1 Diauxie
13 Voir aussi



Historique [modifier]
Dès l'Antiquité, on postulait l'existence d'agents infectieux transmissibles invisibles à l'œil nu.
1546 : Jérôme Fracastor impute la transmission des maladies à des germes vivants, qu'il appelait « seminaria ».
1677 : Découverte des bactéries par le microscopiste hollandais Antoine van Leeuwenhoek.
1828 : Christian Gottfried Ehrenberg utilise pour la première fois le terme bactérie.
1840 : Le pathologiste allemand Jacob Henle propose une « théorie des germes » pour les maladies.
1857-1876 : Louis Pasteur met en évidence les rôles des micro-organismes dans la fermentation lactique et alcoolique. Il développe les techniques de pasteurisation et de stérilisation lui permettant la mise en place de cultures pures de micro-organismes. La possibilité de culture a permis de démontrer que la génération spontanée était une aberration.
1877-1895 : Louis Pasteur démontre que des maladies sont la conséquence de la présence de ces micro-organismes. Premières recherches systématiques sur l'origine de certaines maladies, ainsi que la vaccination (connue depuis Edward Jenner pour la variole - maladie virale).
1873-1882 : Robert Koch met en évidence le bacille responsable de la tuberculose (Mycobacterium tuberculosis). Koch a établi les règles (toujours utilisées) qui permettent de démontrer rigoureusement qu'une bactérie donnée est à l'origine d'une infection.
1884 : Hans Christian Gram développe une technique de coloration qui est la plus utilisée dans l'étude et la classification des bactéries en deux grands groupes : les bactéries à Gram positif et celles à Gram négatif.
1912 : Paul Ehrlich découvre le premier traitement efficace (dérivé d'arsenic) contre la syphilis. C'est la première fois qu'on traite avec un agent chimiothérapeutique une maladie bactérienne.
1917 : Découverte des bactériophages par Frederick Twort et Felix d'Herelle.
1928 : Frederick Griffith découvre la transformation bactérienne et établit les fondements de la génétique moléculaire.
1929 : Alexander Fleming découvre les propriétés antibactériennes de la pénicilline produite par Penicillum. L'humanité entre dans l'ère des antibiotiques.
1944 : Albert Schatz et Selman Waksman découvrent un autre antibiotique: la streptomycine qui sera bientôt utilisée contre la tuberculose.
1960 : François Jacob, David Perrin, Carmen Sanchez et Jacques Monod proposent le concept d'opéron pour le contrôle de l'expression des gènes bactériens.
1977 : Carl Woese étudie l'ARN ribosomal pour découvrir une troisième forme de vie, les Archae, distincte génétiquement des bactéries et des eucaryotes.
1986 : En utilisant une enzyme de la bactérie Thermus aquaticus, Kary Mullis invente la technologie de PCR (Polymerase Chain Reaction). La technique de PCR est devenue l'outil de base de la biologie moléculaire.
1995 : Séquençage complet du premier génome bactérien (Haemophilus influenzae) par Craig Venter et ses collègues du TIGR. La microbiologie entre dans l'ère de la génomique.

Classification [modifier]
L'analyse de la structure interne a permis de déterminer deux groupes de micro-organismes : les procaryotes (ou bactéries, munis d'un proto-noyau) et les eucaryotes (munis d'un vrai noyau)

procaryotes (groupe polyphylétique comprenant en fait des taxons de rangs distincts)
archaea, archéobactéries
eubactéries
eucaryotes (groupe monophylétique ou taxons simples)
algues
champignons
protozoaires
Les deux groupes se sont différenciés très tôt du point de vue phylogénétique.


Caractéristiques [modifier]

Les procaryotes (ou bactéries) [modifier]
Dépourvus de noyau complet, ils appartiennent à au moins deux taxons distincts :

Les archéobactéries ou archées sont un groupe particulier, car il ne comprend essentiellement que des espèces anaérobies (n'ayant pas besoin d'oxygène, voire souvent ne tolérant pas l'oxygène), vivant dans des environnements extrêmes : on parle d'organisme extrémophile. Les environnements extrêmes sont à la limite des conditions tolérées par les cellules biologiques (milieu salin très acide ou très alcalin, milieu à température proche de l'ébullition). Les archéobactéries ne sont pas que des extrémophiles, ce sont aussi des organismes plus communs qui vivent dans des conditions de vie classique comme les marais ou les rumens des ruminants. Il ne faut pas associer systématiquement archéobactéries à des organismes extrêmes même si on retrouve parmi eux la plupart des extrémophiles.
On retrouve les eubactéries dans notre quotidien, sol, nourriture... Ce sont les bactéries les plus connues. Cependant certaines eubactéries sont aussi extrémophiles.
Ces micro-organismes ont des mécanismes pour résister à ces conditions.


Autres règnes [modifier]
La systématique moderne phylogénétique amène à reclasser parmi les procaryotes des espèces autrefois classées dans le règne animal, végétal, ou même fongique (normalement des espèces toutes eucaryotes selon la classification moderne du vivant).

De plus, les espèces eucaryotes multicellulaires (végétales comme animales) ne peuvent vivre sans la présence de certaines bactéries dans le milieu intercellulaire ou dans des organes cavitaires: elles participent à la synthèse (notamment chez les plantes fourragères qui utilisent des bactéries de la famille Rhizobium pour la synthèse et l’assimilation de l’azote) ou la dégradation (par exemple pour la digestion) de certains composés organiques et à la lutte active contre d’autres espèces bactériennes ou virales (pathogènes à cause de leur développement anarchique non symbiotique).

De même la microbiologie s’intéresse de plus en plus aux « espèces » pseudo-cellulaires (organites) présentes dans le noyau ou le cytoplasme de tous les eucaryotes et un grand nombre de procaryotes, où ils « vivent » en symbiose parasitaire endogène (endocytose), et permet de penser que leur origine est celle des archéobactéries ou d'espèces encore plus anciennes.

Ce mode de colonisation des êtres cellulaires eucaryotes ou procaryotes est proche de celle utilisée dans un autre domaine du vivant, les virus, toujours classés dans aucun règne, aujourd’hui étudiés activement par la virologie moderne, surtout pour les besoins de la médecine (traitements antiviraux, ou thérapie génique), mais aussi en botanique et zoologie pour les besoins agricoles (organismes génétiquement modifiés). Dans certains cas, des bactéries sont utilisées comme vecteurs de culture et de transport de ces virus (souvent aussi génétiquement modifiés) chargés d’opérer les modifications génétiques cellulaires.

L’étude fondamentale des procaryotes est essentielle donc pour comprendre l’évolution de toutes les autres espèces des cinq règnes classiques et s’appuie aussi maintenant sur la recherche plus récente en virologie et biologie moléculaire.


Les eucaryotes [modifier]
Les eucaryotes ont un système membranaire interne enfermant des organites (noyau, plaste, mitochondrie...) ; ils présentent un cytosquelette interne (actine, tubuline) absent chez les procaryotes, qui leur confère une taille souvent plus importante que les procaryotes.

On estime que chaque groupe d'eucaryotes a eu un ancêtre parmi les procaryotes (archéobactéries ou eubactéries), et que les mitochondries (et peut-être aussi d'autres organites comme les chloroplastes) présents dans le noyau des eucaryotes actuels ont aussi eu au moins un ancêtre procaryote distinct qui aurait colonisé cette ancienne bactérie pour vivre en symbiose parasitaire (endosymbiose) avec elle et former tous les eucaryotes qui ne peuvent plus vivre sans elles.

En effet, on retrouve dans les mitochondries un cytosquelette interne spécifique, une structure membranaire externe complexe, un matériel génétique interne spécifique logé dans une zone plasmique appelée proto-noyau (dépourvu de membrane mais tout de même structurée), même si les mitochondries ne peuvent se multiplier seules sans le concours de la cellule hôte (les mitochondries auraient perdu leurs facultés de reproduction qui ne leur étaient plus nécessaires, puisque la cellule hôte leur fournit pratiquement tout le matériel nécessaire à leur croissance et leur division).


Algue [modifier]
Contrairement aux champignons et aux protozoaires, les algues ont des pigments chlorophylliens leur permettant de réaliser la photosynthèse.

Les algues sont présentes dans le sol, les plantes, l'eau douce et l'eau de mer. Elles sont autotrophes.


Champignon [modifier]
Les champignons sont présents dans le sol, plantes, débris végétaux, lichen, parasites de l'homme, des animaux et des plantes.

Remarque : une levure, eucaryote unicellulaire, est un champignon. Il existe de nombreuses espèces de levures comme Saccharomyces cerevisiae (levure de boulangerie), la famille des Candida (responsables des candidoses), Rhodotorula (parfois retrouvée dans la choucroute qu'elle colore en rouge), Schizosaccharomyces, etc.
Les champignons sont "absorbotrophes" : ils se nourrissent par absorption. Ils sécrètent des enzymes qui digèrent des polymères dans le milieu extérieur, ce mécanisme chimique transforme par exemple les glucides en monomères (petites molécules) qui sont ainsi absorbés.


Protozoaire [modifier]
Les protozoaires sont des êtres unicellulaires dépourvus de paroi cellulaire (contrairement aux algues). On en trouve dans le sol, l'eau douce, l'eau de mer, mais également comme parasites de l'homme et des animaux. Les protozoaires se nourrissent par pinocytose et endocytose car ils n'ont pas de paroi cellulaire.


Autres règnes [modifier]
Bien que non classés parmi les microbes, les règnes végétaux (avec affinité avec les algues) et animaux (avec affinité avec les protozoaires) sont aussi classés parmi des eucaryotes. Ils ne sont pas classés comme micro-organismes car ils ne vivent pas ni ne se reproduisent à l’état unicellulaire.


La taille des micro-organismes [modifier]
Comme signalé au début, les micro-organismes sont de très petite taille (d'où leur nom) :

procaryotes (bactéries) : de l'ordre de 0,5 à 3 µm (pour la largeur), pas de limite en longueur ; le pouvoir séparateur de l'œil humain est de 100 µm (10-6m soit 0.1 mm), ces micro-organismes sont donc tous invisibles à l'œil nu.
eucaryotes : très variable de 2 à 200 µm (pour la largeur), pas de limite en longueur ; certains eucaryotes sont visibles à l'œil nu (notamment les algues), d'autres ne sont visibles que sous forme d'agrégats (cas des champignons, dont les parois plasmiques émettent des filaments sur une grande longueur relativement à leur taille). Tous les eucaryotes ne s'agrègent pas ainsi (notamment les protozoaires, invisibles à l'œil nu).
Le rapport surface sur volume est directement influencé par la taille : si l'on considère une forme simple telle que la sphère, la surface est proportionnelle au carré de la taille (4πr2 si r est le rayon de la sphère), alors que le volume est proportionnel au cube de la taille (4/3πr3), le rapport surface/volume est donc inversement proportionnel à r (3/r).

Ceci conditionne la vitesse à laquelle le micro-organisme se nourrit : la nourriture passe à travers la membrane plasmique, donc la vitesse d'absorption est proportionnelle à la surface, mais la quantité à nourrir est proportionnelle au volume. La vitesse à laquelle entrent et sortent les nutriments et les déchets est donc inversement proportionnelle à la taille. Donc plus la bactérie est petite, plus elle va pouvoir se nourrir à grande vitesse. Elle compense sa petite taille par une multiplication à très grande vitesse (taux de croissance très rapide).


La culture des micro-organismes [modifier]

Richesse du milieu [modifier]
Les micro-organismes ont besoin :

D'une source d'énergie.
Pour les chimiotrophes, elle provient de la dégradation de composés chimiques (par exemple du glucose)
Pour les phototrophes, de la lumière.
D'une source de carbone
Pour les autotrophes, il suffit de CO2 atmosphérique (carbone minéral).
Pour les hétérotrophes, elle provient de molécules organiques (CH4, oses...)
De macroéléments (Ainsi appelés en raison de leur concentration dans le milieu de culture)
C, H, O, N, S, Na, Mg, P, K
Les éléments carbone, azote, phosphore doivent être présents aux proportions 100/10/1 pour un milieu correct.

De microéléments
Cu, Co, Zn, Cl, Fe...
D'une source d'azote
D'origine minérale (sel d'ammonium)
De facteurs de croissance
Vitamines, acides aminés
De dioxygène ou oxygène moléculaire
Pour les aérobies strictes
— ou —
d'absence de dioxygène (ou oxygène moléculaire) anaérobies stricts; pour ces micro-organismes, le peroxyde d'oxygène (H2O2) formé par la réaction entre l'O2 et l'H2O les empoisonnent, car ils ne possèdent pas une catalase dégradant H2O2 à l'inverse des individus aérobies.
Il existe également des micro-organismes aérobies facultatifs capables de se multiplier en présence ou en l'absence d'oxygène grâce à leur capacité à utiliser la fermentation et des bactéries microaérophiles qui ne se développent qu'à une certaine pression en dioxygène.

De facteurs physico-chimiques:
Pour le facteur température, on distingue trois catégories de micro-organismes selon leur optimum de croissance. Les psychrophiles ont leur optimum à 15 °C, les mésophiles à 37 °C, les thermophiles à 65 °C.
Il faut descendre au-delà de -18 °C pour arrêter toute croissance microbienne. À 3 °C il y a peu de risques lié aux bactéries pathogènes (mésophiles, donc virulentes à la température du corps) ou toxinogènes, seules quelques bactéries vivant à ces températures peuvent être dangereuses (listéria).
Pour le facteur pH, on considère que les bactéries préfèrent la neutralité excepté pour les bactéries lactiques. Pour les levures et moisissures, le pH optimum est plus acide. (pH=5)

Diversité du milieu de culture [modifier]
On distingue deux sortes de milieux de culture :

Synthétiques : milieux dont on peut donner la composition chimique complète. Les milieux synthétiques sont utilisés en recherche fondamentale.
Empiriques : milieux dont on ne connaît que partiellement la composition.
et parmi ces 2 types de milieux, il existe des milieux sélectifs (qui vont permettre de sélectionner le type de micro-organismes qui pourront s'y multiplier). On peut ainsi choisir de ne laisser se développer qu'un genre de bactérie donné (ex: milieu mFC pour les coliformes fécaux ou gélose au sang pour certains pathogènes) ou au contraire de favoriser le développement des levures-moisissures en ajoutant un antibiotique au milieu. La température à laquelle on incubera les milieux inoculés constitue également un facteur de sélection comme mentionné plus haut.

Les milieux de culture peuvent contenir des extraits de levure (cellules de levure déshydratées et lysées) qui fournissent une source d'acides aminés, de vitamines et d'azote, des extraits de malt apportant une source de carbone, des peptones (protéines animales, de poisson, de caséine de lait) source d'azote organique qui intéresse les individus hétérotrophes.

Ces milieux sont soit liquides, soit solides. Pour solidifier le milieu on utilise fréquemment la gélose ou agar-agar, un polymère de sucre tiré d'une algue rouge présentant la propriété de former avec l'eau un gel solide si la température est inférieure à 60°C.


La stérilisation [modifier]
La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet et ce, de manière durable. En microbiologie, le but de la stérilisation est d'une part maîtriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part éviter la contamination du milieu extérieur et des personnes (voir aussi l'article sur l'hygiène).

Il existe trois façons pour stériliser un milieu de culture. Une destruction par la chaleur, par une méthode de filtration ou par l'emploi de radiation et d'agent chimique (gaz)


La chaleur [modifier]
On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».


Figure 1 : Zone de stérilité d'un bec Bunsen.Chaleur sèche :
Bec Bunsen : tout l'air qui se trouve dans un globe virtuel de 15 cm de rayon de la flamme d'un bec Bunsen, est passé une fois dans la flamme. Ceci crée une enceinte fictive stérile. Les microbiologistes travaillent avec une flamme oxydante qui crépite.
Four Pasteur ou four Poupinel : C'est un four classique utilisé à 180°C pendant 90 minutes au minimum.
Chaleur humide :
Autoclave : cette technique consiste à faire bouillir de l'eau dans une enceinte close pour augmenter la pression et donc dépasser les 100°C d'ébullition (principe de l'autocuiseur). Ceci est réalisé à 121°C pendant 15 minutes au minimum.

Cas particuliers : la pasteurisation et tyndallisation [modifier]
Cette technique ne détruit qu'une partie de la flore bactérienne. Ce n'est, en aucun cas, une technique de stérilisation.

La tyndallisation est une série de chauffages brefs à des températures de 70°C à intervalles réguliers (3 chauffages d'une heure, 24 h entre 2 chauffages), ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant. Par exemple, la destruction des germes pathogènes du lait se fait par un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C pendant 15 minutes.

L'ébullition n'est pas une méthode de stérilisation. Les formes sporulées des bactéries résistent jusqu'à 8h30 à 100°C.


La filtration [modifier]
La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 µm ; les micro-organismes sont trop gros pour passer et sont donc retenus par le filtre. Pour forcer ce liquide à traverser le filtre on utilise deux solutions:

mise en pression du liquide par l'intermédiaire d'un piston.
aspiration du liquide en créant par exemple une enceinte dépressurisée de l'autre côté du filtre.
Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles (c'est-à-dire qui ne résistent pas à la chaleur) comme certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne partie des antibiotiques. Cependant les filtres de 0.2 µm colmatent vite. On peut contourner ce problème en augmentant la surface du filtre ou en utilisant un procédé de filtration tangentielle.

Dans certains cas le filtre ayant servi à stopper les micro-organismes peut être déposé sur un milieu de culture solide afin de permettre la multiplication des germes, ceci dans le but de procéder à leur dénombrement et à leur identification.


Radiation et agent chimique [modifier]
Ces techniques sont utilisées par les industries dont l'alimentaire. Elles sont très pénétrantes car les radiations et certains gaz traversent le plastique et tuent les micro-organismes. Les rayons ultraviolets ne sont cependant pas une bonne technique de stérilisation car ils sont non pénétrants, donc ils ne passent pas au travers de matériaux comme le plastique et le verre. De plus certains micro-organismes sont capables de réparer les dommages infligés par les ultraviolets si le produit est éclairé après application de rayons ultraviolets; c'est le phénomène dit "de photo-réparation". On peut dans certains cas utiliser le rayonnement gamma, beaucoup plus pénétrant et puissant que les ultraviolets.


Notion de culture pure [modifier]

Technique des stries [modifier]
Elle est basée sur la notion d'UFC (Unité Formant une Colonie). Chaque unité cellulaire (une cellule, un groupe de cellules ou un morceau d'hyphe) va donner une colonie. Sur un milieu de culture, il y a formation d'un monticule de bactéries ou de levures avec une forme particulière (la colonie). La forme de ce monticule est déterminée par l'organisation de la colonie, qui elle-même est déterminée génétiquement. Les champignons vont, eux, développer un thalle c'est-à-dire ce que l'on peut par exemple observer sur les confitures ayant "moisi". L'UFC est utilisée aussi pour le dénombrement bactérien en utilisant des cultures sur boîte à partir de tubes préparés par dilutions en cascades de la suspension bactérienne mère. L'observation macroscopique de l'aspect des colonies permet de différencier les colonies de bactéries contaminantes de celles qu'on cherche à isoler.


Technique de suspension dilution [modifier]
Cette technique sert à évaluer le nombre de microorganismes qui se trouvent dans un milieu liquide (eau de puits, boissons, eau de piscine...) ou dans un milieu solide (sol, aliments...). Elle peut aussi servir à isoler une souche pure à partir d'un mélange. Il s'agit simplement d'une suite de dilutions suivie d'un prélèvement d'un aliquot qui sera étalé sur un milieu de culture qui pourra être sélectif ou non. Il suffira ensuite de compter le nombre de colonies, et connaissant le volume de l'aliquot (en général 1 mL sur une boîte), on en déduira la quantité approximative de bactéries dans le milieu (on considère qu'1 UFC correspond à 1 bactérie).


Identification des bactéries [modifier]
L'identification des bactéries se fait suivant une clé dichotomique qui va des caractères les plus vastes aux plus pointus pour aboutir à une espèce bactérienne donnée.


Critères morphologiques [modifier]
L’étude de la morphologie bactérienne est le premier acte effectué par un laboratoire de diagnostic pour identifier une bactérie. L'observation de la morphologie bactérienne permet une orientation préliminaire du diagnostic.


Macroscopique [modifier]
A l'œil nu, on peut distinguer les caractéristiques d'une colonie:

La forme du relief
La taille
La couleur
L'aspect (collant, filamenteux...)
L'odeur
La transparence
L'allure des contours

Microscopique [modifier]

Coloration de Gram [modifier]
Les bactéries étant en général quasiment transparentes, on commence par préparer un étalement sur lame de microscope auquel on applique une coloration de Gram. Les bactéries à Gram positif apparaîtront mauves alors que celles à Gram négatif apparaîtront roses. Il existe d'autres colorations, comme par exemple celle au vert de malachite permettant de mettre en évidence les formes sporulées.
La coloration de Gram permet de déterminer le type de paroi cellulaire.


Forme [modifier]
La forme est extrêmement diverse au sein du monde bactérien. Si on excepte les bactéries dépourvues de paroi (Mycoplasmes), qui peuvent être très polymorphes, la diversité est relativement restreinte pour les bactéries d’intérêt médical et vétérinaire. Parmi celles-ci, on distingue principalement des formes sphériques (cocci), cylindriques (bacille), spiralées (spirille), enroulées (spirochète) à appendice bourgeonnante ou filamenteuse.

Mode de groupement [modifier]
Elles peuvent se regrouper en chaînes (Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus...), en amas asymétriques ou grappes (Staphylococcus), en amas cubiques réguliers (sarcines), en palissades ou en paquets d’épingles (Corynebacterium)... Le mode de groupement, à condition de l’apprécier sur une culture jeune effectuée en milieu liquide et de tenir compte de l’aspect prédominant, est également un élément important pour orienter l'identification.

Taille [modifier]
Les plus petites bactéries ont une taille de 0,1 à 0,2 micromètre (Chlamydia) alors que certaines ont un diamètre supérieur à 10 micromètres. La plus grande bactérie connue (Thiomargarita namibiensis) peut atteindre un diamètre de 750 micromètres.

Présence de spore [modifier]
Toutes les bactéries n'ont pas la possibilité de sporuler. Il faut noter que la totalité des bacilles à Gram + sporulent en situation de stress. Pour mettre en évidence les spores au microscope optique, il suffit de les colorer au vert de malachite. Mais on peut les deviner à la coloration de Gram (absence de coloration).

Mobilité [modifier]
Les bactéries peuvent être équipées d'un ou plusieurs flagelle(s) leur permettant de se déplacer.
Pour définir le mode de déplacement des bactéries, on parle de chimiotactisme. La bactérie évoluant dans un milieu se déplace selon des gradients de concentration pour se rapprocher de sa "nourriture"


Capsule [modifier]
La capsule est formée de polymères (polysaccharides ou protides) disposés en couches à la périphérie de la bactérie. Celle-ci permet à la bactérie d'adhérer aux surfaces (coloniser les surfaces) et d'échapper au système immunitaire car les antigènes de surface sont recouverts par la capsule qui les rend indétectables (pouvoir pathogène).

Critères biochimiques [modifier]
On identifie aussi une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat. On la met donc en contact dans un milieu de culture avec un glucide, ou un peptide, ou d'autres substrats plus complexes. On peut révéler l'utilisation de ce substrat par virage (changement de couleur) d'un indicateur de pH car un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un produit basique, etc. Chaque famille de bactéries a des caractères propres, on peut donc les rassembler facilement avec des caractéristiques de base comme l'utilisation du glucose avec ou sans oxygène, la réduction des nitrates, etc. Ensuite, on dispose de galeries d'identifications biochimiques qui sont parfois vendues par des sociétés spécialisées. Ces tests sont assez longs, de un à deux jours.


Critères génétiques [modifier]
On peut citer des techniques de génie génétique comme:

- la PCR (Polymérase Chaine Reaction) pour cibler un gène présent uniquement chez une famille ou un genre bactérien par réhybridation spécifique de courtes séquences d'ADN (oligonucléotides amorces) synthétiques précises.

- les puces à ADN qui utilisent le même principe mais ayant une précision allant jusqu'à la souche même.


Systématique bactérienne [modifier]
La systématique permet d'identifier une souche bactérienne inconnue grâce à différents examens et à l'utilisation de milieux de culture spécifiques.

La coloration de Gram et les tests de la catalase et de l'oxydase permettent de déterminer la famille. Des milieux de cultures spécifiques permettent d'arriver au genre et à l'espèce. Des examens supplémentaires tels que le sérogroupage peuvent être utilisés dans certains cas.


Coques à Gram positif et catalase positive [modifier]
Famille des Micrococcaceae
Genre Micrococcus
Genre Staphylococcus

Coque à Gram positif et catalase négative [modifier]
Famille des Streptococcaceae
Streptocoques des groupes A, B, C, D (Enterococcus), F & G

Coque à Gram négatif [modifier]
Cette section est vide ou n'est pas assez détaillée, votre aide est la bienvenue !
Famille de Neisseriaceae
Genre Neisseria




Bacille à Gram positif [modifier]
Genre Bacillus

Bacille à Gram négatif [modifier]
Genre Pseudomonas

Oxydase négative [modifier]
Classement des entérobactéries :

Famille des Salmonelleae
Famille des Escherichieae
Sérogroupage des Escherichiae Coli
Genre Shigella
Famille des Klebsielleae
Genre Klebsiella
Genre Enterobacter
Genre Serratia
Famille des Proteae
Genre Proteus
Genre Morganella
Genre Providencia
Famille des Yersinieae

Oxydase positive [modifier]
Pseudomonas
Vibrio
Aeromonas

Les agents antibactériens [modifier]

Les agents physiques [modifier]
Ont peut citer les agents suivants :

La chaleur : à partir de 65°C, les protéines sont dénaturées, cependant certains micro-organismes sont capables de supporter des températures plus élevées.
Le pH : qu'il soit trop acide ou trop basique.
Les hautes pressions : à partir de 6 000 bars. Ainsi, c'est avec un traitement par la pression que l'on stérilise les jus de fruits produits en industrie.
L'Aw : moins il y a d'eau libre dans un milieu, moins les bactéries pourront se développer (Staphylococcus aureus se développe à partir d'une Aw de 0,83 )
Les UV : pour une longueur d'onde voisine de 260 nm, ils détruisent tous les micro-organismes. Peu efficaces à travers les plastiques, ils sont utilisés pour stériliser l'air.
Les rayons gamma : comme les UV, ils sont très efficaces. Ils peuvent traverser tous les plastiques et servent donc à la stériliser les instruments comme les fls chirurgicaux par exemple. Leur utilisation a été tentée pour les produits alimentaires, sans succès auprès du public.

Les agents chimiques [modifier]
à suivre


Les antibiotiques [modifier]
Les antibiotiques sont des substances chimiques qui ont une action spécifique avec le pouvoir de limiter la prolifération de bactéries spécifiques. Elles sont dépourvues de toxicité pour les autres cellules (champignons et autres eucaryotes). Ces molécules peuvent avoir une action drastique, c'est-à-dire bactéricide; leur efficacité peut être également limitée à empêcher le développement des bactéries (on parle alors d'action bactériostatique).

Voir l'article détaillé Antibiotique.


Les résistances aux antibiotiques [modifier]
Voir l'article Antibiotique > Les résistances aux antibiotiques.


La croissance bactérienne [modifier]
C'est le pouvoir ou la capacité des bactéries à augmenter leur nombre ; il est en fonction du type de bactéries (thermophyles / mésophyles / pscychrophyles / pscychrotrophes / etc.) Quand des bactéries sont incubées dans un milieu liquide adéquat, elles continuent généralement à se multiplier de façon exponentielle jusqu'à ce qu'un facteur nécessaire à leur croissance approche de l'épuisement et devienne limitant ou que des produits métabolites inhibiteurs (acides organiques, alcools, ammoniaque, etc.) s'accumulent exagérément. Cette culture, pratiquée sans addition de nutriment ni élimination de déchets en cours de croissance, s'appelle une culture en milieu discontinu ou en batch qui constitue un système clos. Une culture de ce type se comporte comme un organisme muticellulaire avec une limitation de croissance génétiquement déterminée.

On peut représenter graphiquement la croissance d'une culture de ce type en portant le logarithme du nombre de cellules viables en fonction du temps. La courbe obtenue pourra être divisée en quatre phases : 1- phase de latence = x, 2- phase de croissance logarithmique de x à X, 3- phase stationnaire = X et 4- phase de décroissance exponentielle de X à 0.


Diauxie [modifier]

Figure 4 : Courbe de croissance dans un milieu contenant deux glucides (par exemple : I : utilisation du glucose et II : utilisation du lactose).En présence de deux sources de carbone, les bactéries exhibent une courbe de croissance biphasique. L'analyse de ce comportement à permis à Jacques Monod de définir la notion d'opéron.


Voir aussi [modifier]
issaka salia ousseini
4 année de BIOAAP(BIOtechnologie Appliquée à l'Amelioration des Plantes)
email:issakasalia@yahoo.fr
tel:0021274228656

Il est désormais une règle presque établie que les conflits du monde contemporain suivent souvent la géopolitique pétrolière, aurifère, diamantifère et autres ressources naturelles. L’exemple le plus illustratif de cette assertion nous a été donné par l’actuelle guerre d’Irak où, sous le fallacieux prétexte que Saddam Hussein disposerait d’armes de destruction massives, l’Administration néo-conservatrice de Georges Bush a envahi cet Etat souverain dans le seul but de s’emparer, en réalité, de son trésor pétrolier, estimé le troisième du monde. Chez nous au Niger, suivant la même logique, il a été constaté que la rébellion armée n’a éclaté nulle part ailleurs dans le pays, que justement dans la zone qui regorge d’immenses potentialités minières et énergétiques. En effet, couvrant les deux tiers de la superficie totale du Niger, la Région d’Agadez dispose d’importants gisements en tous genres, allant de l’uranium, du charbon, du pétrole, du gaz naturel en passant par l’or et autres métaux précieux.

De toutes ces richesses minières, seuls l’uranium et le charbon ont fait l’objet d’exploitation au lendemain de notre indépendance. Pour tout le reste, seuls les manuels scolaires avec les différentes cartes de géographie nous apprenaient l’existence de ces immenses richesses enfouies dans notre sous/sol. Si la politique énergétique menée au début des années 80 par le Conseil Militaire Suprême du Général Seyni Kounché avait permis de doter le pays d’infrastructures modernes telles que les routes, les bâtiments administratifs et certains aménagements hydro- agricoles grâce à une politique volontariste hardie, force est de constater que la chute vertigineuse du cours de l’uranium qui intervint au milieu des années 80, n’avait guère facilité à ses successeurs de maintenir le cap. Ainsi, d’année en année, le prix de l’uranium ne faisant que chuter, le Niger était quotidiennement en proie à une raréfaction des ressources, ce qui aura un impact direct sur le développement économique et social du pays. C’est pourquoi, tous les gouvernements qui se sont succédé à la tête du pays depuis la mort de Seyni Kountché ont eu comme handicap majeur le manque de ressources susceptibles de relancer l’économie qui finira par être mise sous perfusion par la Banque Mondiale et le FMI.Parallèlement, pendant que les ressources poursuivaient une courbe descendante, les effectifs de la population, quant à eux, empruntaient une pente ascendante, ce qui finira par poser le problème de l’adéquation entre les ressources disponibles et les besoins à satisfaire. La prise de conscience de 2004 La flambée historique du prix du baril de pétrole, suite notamment au déclenchement de la guerre en Irak, les menaces persistantes que fait peser l’Occident sur l’Iran pour son enrichissement d’uranium à des fins militaires et aussi les difficultés structurelles de notre grand voisin, le Nigeria, pour approvisionner son propre marché, tous ces facteurs donc, ont largement contribué à une prise de conscience des autorités politiques sur la nécessité de mettre en valeur tout ou une partie de ce potentiel minier afin d’assurer et de garantir l’indépendance énergétique du pays. Si dans les années 60 et 70, voire 80, à cause de la faiblesse du prix du baril (12 à 15$ US), le pétrole nigérien n’était pas économiquement rentable, le boom actuel que connaît l’or noir le rend compétitif et surtout susceptible de constituer une source importante de devises pouvant permettre à l’Etat de répondre efficacement aux impératifs du développement. Pendant longtemps les compagnies pétrolières traditionnelles ne s’intéressaient guère au pétrole nigérien, tout comme celui de notre voisin tchadien, dont elles minoraient les réserves. Ici il convient de faire un parallèle entre le cas du Tchad et celui du Niger. Pendant longtemps les tchadiens avaient conscience de l’énorme potentiel pétrolier qui dormait dans leur désert, mais faute de stabilité dans la région en proie à une éternelle guerre civile larvée et entretenue par la Libye, avait toujours rendu impossible son extraction. Chez nous au Niger, le scénario est identique : dès que nous eûmes appris que nos réserves pétrolières seraient importantes, cela réveilla les convoitises des uns et des autres. La conjoncture internationale ayant presque contraint l’Etat nigérien à revoir de manière approfondie sa politique minière, celui-ci multiplia les pistes d’exploration en facilitant l’octroi de licences aux compagnies de prospection qui le désiraient. Mais aussitôt que cette première phase fut achevée, on constata un regain d’activisme armé dans cette partie du Niger, avec les attaques répétées des bases militaires, des mines sont disséminées pour rendre impraticables les sites de prospection, bref il commençait à devenir dangereux pour les compagnies de recherches de continuer sereinement leurs activités. Pourquoi justement maintenant ? Maintenant, parce que, pour ces forces, apparemment à la solde de puissances étrangères, il est primordial d’empêcher, par tous les moyens, au Niger d’exploiter et de jouir pleinement de ses ressources minières ! Pour ce travail de sape, des Nigériens sont utilisés pour tuer, massacrer et brûler tout ce qui peut symboliser l’Etat. Les mains invisibles de l’étranger D’après certains constats, d’ailleurs officiellement reconnus par nos autorités politiques, l’arsenal de guerre dont disposerait le MNJ serait ’’ de la dernière génération’’ et on ne voit pas comment, objectivement, en si peu de temps, le MNJ aurait pu se le procurer s’il n’y avait pas derrière lui une main invisible qui l’approvisionnerait ! En effet, si par le passé, nous avions connu le FLAA, les FARS et autres mouvements rebelles qui avaient signé les accords de paix de Ouaga en Avril 1995, le MNJ n’a été connu des Nigériens qu’en 2007, juste après la célébration du … Mouloud à Agadez ! Vérités ou simples coïncidences ? En tout état de cause, la même coïncidence avait été observée au Mali, un an plutôt, à l’occasion de la même célébration du Mouloud à Tombouctou : une attaque sur Kidal s’en était suivie ! Autre coïncidence troublante, après le bref séjour de Kaddafi en Côte d’Ivoire, l’avion du Premier Ministre Guillaume Soro avait fait l’objet de tirs de roquettes, et heureusement, l’enfant terrible des Forces Nouvelles avait eu la baraka. Pour nous au Niger, ce qui accréditerait l’implication étrangère, c’est cette noria de rotations aériennes, à l’occa sion du Mouloud, sur Agadez qui aurait acheminé quantité de bagages pour les Chefs d’Etat présents à cette manifestation religieuse. Beaucoup de Nigériens supposent qu’en réalité, le point de départ du MNJ daterait de ce jour-là. D’autre part, un autre fait troublant, le rapatriement manu militari d’un expert français, conseiller en sécurité chez AREVA, la compagnie qui extraie l’uranium au Niger : pourquoi ? Pourquoi cette déstabilisation dans le grand Nord et à quoi joue le MNJ ? Cela fait pratiquement vingt ans que le Nord de notre pays a été transformé en une zone d’insécurité permanente. De par sa situation géographique qui la relie à l’Afrique du Nord, porte d’entrée en Europe pour tous les desespérado africains qui fuient la misère et la précarité dans leurs pays, la région d’Agadez apparaît comme un no mans land régulièrement sillonné par de nombreux trafiquants de tous genres, les terroristes salafistes algériens ainsi que les ex-combattants des rebellions antérieures. C’est également une zone où l’on peut constater une forte circulation des armes de guerre. De par l’immensité de l’Aïr et de l’Azawak, l’Etat du Niger ne dispose point de moyens suffisants, aussi bien en matériels qu’en hommes, pour quadriller cette Sibérie désertique du Sahel. L’Etat, en fait, se contente d’une présence symbolique en disséminant quelques casernes et en déployant des forces sur les sites miniers pour les protéger. Conjuguant à la fois les défauts de l’immensité et de l’inhospitalité avec les avantages de très grandes potentialités minières et énergétiques que regorgent ses sous/ sols ergotiques, la région d’Agadez peut être, à juste titre, considérée comme le premier poumon économique du Niger. On comprend très bien que la moindre onde de choc qui secoue cette région soit durement ressentie par tout le reste du pays, faisant dire à certains observateurs, quand Agadez éternue, le Niger s’enrhume ! Les migrations internes du Sud vers ce grand Nord se justifient donc par l’attrait d’emplois que ses villes minières procurent à ces exodants, constitués par une bonne partie de la jeunesse nigérienne, déboussolée dans une société qui a cessé d’offrir des perspectives meilleures à ses enfants. Pour bon nombre d’observateurs, cette déstabilisation chronique dont est victime le Nord de notre pays n’aurait d’autre justification objective que le désir, la volonté d’un encombrant voisin de nous garder toujours dans l’assistanat, faisant de notre pays son obligé, son objet de manipulation diplomatique. C’est vrai, comme l’a dit un grand Hadith du Prophète de l’Islam (PSL), on ne choisit pas ses voisins, mais on choisit ses amis, aussi appartiendra-t-il, désormais, aux autorités de notre pays de savoir adopter l’attitude qui sied à l’égard de certains de nos voisins qui nous poignardent dans le dos, le sourire sur les lèvres ! Même si nous sommes pauvres, enclavés, nous n’en sommes pas moins capables de distinguer ceux qui nous aiment réellement de ceux qui font semblant. Une vérité se doit d’être dite ici : les richesses du Niger appartiennent à l’ensemble des Nigériens sans exclusive. Qu’on déclenche une guerre meurtrière sous le fallacieux prétexte que les ressortissants d’Agadez ne profitent point des retombées des extractions minières est un argument qui défie la réalité. Car, seul au Niger, une loi stipule que 15% des retombées minières sont laissées à la région. Nulle part ailleurs, dans aucun pays du monde, ce taux ne dépasse 10% ! En réalité, pour tout ce qui précède, nous avons l’intime conviction à ‘’OPINIONS’’ que le MNJ est composé de marionnettes résolument à la solde de l’étranger. Aujourd’hui, après les graves évènements du mois passé, il convient de se ressaisir et déposer les armes. La bataille n’en vaut pas la chandelle


issaka salia ousseini
email:issakasalia@yahoo.fr

la nigérienne

Auprès du grand Niger puissant
Qui rend la nature plus belle
Soyons fiers et reconnaissants
De notre liberté nouvelle

Évitons les veines querelles
Afin d'épargner notre sang
Et que les glorieux accents
De notre race sans tutelle

S'élèvent dans un même élan
Jusqu'à ce ciel éblouissant
Où veille son âme éternelle
Qui fera le pays plus grand

Debout Niger ! Debout !
Que notre œuvre féconde
Rajeunisse le cœur
De ce vieux continent

Et que ce chant s'entende
Aux quatre coins du monde
Comme le cri d'un peuple
Équitable et vaillant

Debout Niger ! Debout !
Sur le sol et sur l'onde
Au rythme des tam-tams
Dans leur son grandissant
Restons unis toujours
Et que chacun réponde
A ce noble avenir
Qui nous dit: "En avant !".

issaka salia ousseini:etudiant en 4 année de biotechnologie végétale
email:issaka salia ousseini
tel:00212 74 22 86 56